Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.
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Artigo de método
Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os mosquitos transmitem uma série de vírus diferentes, incluindo importantes patógenos humanos, tais como vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue eo vírus chickungunya. Muitos desses vírus se intensificaram nas suas gamas endêmicas e se expandiu para novos territórios, necessitando de programas eficazes de vigilância e controle para responder a essas ameaças. Uma estratégia para monitorar a atividade do vírus envolve a coleta de um grande número de mosquitos dos locais endêmicos e testá-las para a infecção viral. Neste artigo, descrevemos como lidar, processo e tela de campo coletados mosquitos de vírus infecciosos de células Vero por ensaio de cultura. Os mosquitos são classificadas por localização armadilha e espécies, e agrupados em pools contendo ≤ 50 indivíduos. Espécimes agrupados são homogeneizados em salina tamponada com um misturador-mill ea fase aquosa é inoculada em culturas de células Vero confluentes (Clone E6). Culturas de células são monitorados para efeito citopático do dia 07/03 pós-inoculação e qualquer vírus cresceu em cultura de células são identificadas pelos testes de diagnóstico apropriado. Ao utilizar esta abordagem, temos isolados 9 tipos diferentes de vírus a partir de mosquitos coletados em Connecticut, EUA, e entre estes, cinco são conhecidos por causar doenças no homem. Três destes vírus (vírus do Nilo Ocidental, vírus Potosi e La Crosse vírus) representam novos registros para a América do Norte ou da região da Nova Inglaterra desde 1999. A capacidade de detectar uma grande diversidade de vírus é fundamental para monitoramento ambos estabelecidos e vírus emergentes na população de mosquitos.
Protocolo
1. Triagem e identificação de mosquitos
- Os seguintes procedimentos são realizados em uma bancada de laboratório aberto em uma dedicada biossegurança de nível 2 (BSL-2) por pessoal de laboratório que são treinados para trabalhar com os mosquitos vivos. A "cadeia de frio" é mantida durante todo o procedimento.
- Anestesiar os mosquitos adultos vivem colocando bolsa coletora de mosquito em um freezer -20 ° por 5 minutos. Saco de transferência de coleção para um recipiente isolado contendo gelo seco. Feche a tampa e expor mosquitos para dióxido de carbono durante 1-3 minutos para garantir a completa knock-down.
- Toque mosquitos anestesiados em....
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Discussão
Vero ensaio de cultura celular serve como um método eficaz para mosquitos tela de campo recolhidas para uma diversidade de vírus. Isto contrasta com os métodos moleculares que atingem especificamente a um ou alguns vírus de interesse. Além disso, descobrimos que ensaio de cultura de células Vero é tão ou mais sensível do que a RT-PCR 7 e fornece-nos isolados do vírus que são armazenados em nossa coleção de referência para estudos futuros. No entanto, os sistemas de cultura de células pode não ser apropriada e.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos as importantes contribuições dos drs. John Anderson, Andrew principal e Shirley Tirrell a este estudo. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e do Departamento de Agricultura dos EUA (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / equipamentos | Companhia | Número de catálogo | |
| Soro fetal bovino | Gibco - Invitrogen | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco - Invitrogen | 15240 | |
| De bicarbonato de sódio NaHCO 3, Soln 7,5%. | Gibco - Invitrogen | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 | |
| Meio mínimo essencial em pó (MEM) | Gibco - Invitrogen | 11700 | |
| 10X Dulbecco PBS | Gibco - Invitrogen | 14080 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco - Invitrogen | 15400 | |
| Soro de coelho | Gibco - Invitrogen | 16120 | |
| Células Vero (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Frascos de cultura de tecido pequena, tampas ventiladas, 25 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353112 | |
| Frascos grandes de tecido de cultura, tampões ventilados, 175 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353108 | |
| Cobre revestido do BB, 4,5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Moinho | Retsch | MM300 | |
| Freezer racks Isopack | Eppendorf | 022510240 |
Referências
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 ....
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Reimpressões e permissões
