Low-Cost Cryo-Light Fabricação Stage Microscopia de Luz Correlacionados / Microscopia Eletrônica

Resumo

Nós demonstramos a fabricação de um estágio de baixo custo criogênicos projetados para caber mais microscópios de luz refletida. Nesta fase de laboratório construído criogênicos permite eficiente e confiável imagem correlativa entre crio-luz e crio-microscopia eletrônica.

Resumo

O acoplamento de crio-microscopia de luz (crio-LM) e crio-microscopia eletrônica (Cryo-EM) apresenta uma série de vantagens para a compreensão da dinâmica celular e ultra-estrutura. Primeiro, as células podem ser visualizados em um ambiente quase nativo para ambas as técnicas. Segundo, devido ao processo de vitrificação, as amostras são preservadas por imobilização física rápida, em vez de fixação química lenta. Terceiro, a imagem da mesma amostra com ambos crio-LM e crio-EM fornece correlação de dados de uma única célula, ao invés de uma comparação de "amostras representativas". Enquanto esses benefícios são bem conhecidos a partir de estudos anteriores, o uso generalizado de correlativo crio-LM e crio-EM continua a ser limitado devido ao custo e complexidade de comprar ou construir um palco adequado criogênicos microscopia de luz. Aqui demonstramos a montagem e utilização de um estágio criogênico barato que pode ser fabricado em qualquer laboratório para menos de US $ 40 com peças encontradas no local de hardware e mercearias. Nesta fase crio-LM é projetado para uso com microscópios de luz refletida, que são equipados com objectivos a longo aéreo que trabalham à distância. Para correlativo crio-LM e crio-EM estudos, adaptar o uso de carbono revestido padrão de 3 mm Cryo-EM suporta redes como amostra. Depois de adsorção da amostra para a rede, protocolos previamente estabelecidos para vitrificação da amostra e transferir / manipulação da grade são seguidos para permitir a técnica de multi-imagens. Como resultado, essa configuração permite que qualquer laboratório com um microscópio de luz refletida para ter acesso a imagens correlativo direto de amostras congeladas hidratado.

Protocolo

1. Fabricação e Montagem

1. Coloque o dissipador de calor de alumínio dentro do 22,96 centímetros (9 ") pie pan aproximadamente 2 cm do lado da panela, como mostrado na Figura 1c Usando uma caneta preta, marque os orifícios para o dissipador de calor de alumínio Nota:.. Se o alumínio bloco (comprado em uma loja local de sucata de metal ou online em http://www.onlinemetals.com ) não vem com furos pré-perfurados, você terá que providenciar a furos e rebaixada antes da etapa 1 para assegurar o alumínio bloco para o pan torta. Costumávamos 5 furos para fixar o bloco para a plataforma e 4 furos extra para permitir bolhas de gás nitrogênio para escapar sob o alumínio.
2. Coloque a caixa crio grade perto do local do dissipador de calor de alumínio e marcar o entalhe e cada lado.
3. Faça furos piloto para cada posição marcada com um bit # 17 broca para o alumínio furos do dissipador de calor e um pouco # 35 broca para os furos de crio-grade de caixa.
4. Montar o dissipador de calor de alumínio com 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 ") de cabeça chata parafusos de fenda e porcas correspondentes, bem como 15 - # 10 arruelas Coloque duas arruelas sob o bloco de alumínio ea terceira na parte traseira do. pie pan para cada buraco Nota:. overhangs inseguros do bloco de alumínio próximo a área de visualização pode resultar em vibrações que limitam a capacidade de imagem do palco Verifique se todos os parafusos de fixação estão bem apertados..
5. Inserir 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") completam os parafusos e porcas slotted correspondente da parte traseira da bandeja da torta para atuar como o crio-grade caixa de montagem.
6. Tape 4 pauzinhos juntos em pares com um pauzinho em cima de outro. Par de fita para cada margens opostas do pan bolo para atuar como espaçadores.
7. Superfície molhada superior e inferior do bolo e torta de panelas, respectivamente, com DDH ₂ O.
8. Encha a bandeja de bolo com duas camadas de espuma isolante spray. Molhar cada camada antes de ir para a próxima etapa.
9. Pressione a bandeja da torta na espuma.
10. Virar as panelas de cabeça para baixo e pressione no pan bolo até os espaçadores em contato com o pan torta. Coloque qualquer objeto pesado em cima da bandeja de bolo e deixe descansar durante a noite para a cura.
11. Com uma faca serrilhada, corte o excesso de spray de espuma isolante secas a partir da borda das panelas e remover os pauzinhos.
12. Retire a panela do bolo da bandeja da torta. O pan torta com dissipador de calor de alumínio é agora isolado e será referido como o "estágio criogênico" (Fig. 1a).
13. Coloque uma prancheta de plástico transparente (qualquer cor e superior a 3 mm de espessura) sobre a parte superior do palco criogênicos. Marca com um marcador preto a localização da caixa de montagem crio-grade por desenhar um círculo de aproximadamente 1,5 vezes o diâmetro de uma única rodada crio grid-caixa. Cortar buraco com um 1,9 centímetros (3 / 4 ") buraco viu. Esta área de transferência será referida como a" tela de carregamento "(Fig 1b).
14. Coloque uma nova área de transferência transparente em cima do palco criogênico e colocar no microscópio com o dissipador de calor diretamente sob as lentes objetivas. Com um marcador preto, marca o caminho dos objectivos enquanto giram.
15. Corte ao longo da linha marcada a remoção de um meio círculo da borda da área de transferência. Isso pode ser feito com um quebra-cabeças ou utilizando um 7,62 centímetros (3 ") buraco viu várias vezes, como mostrado no vídeo.
16. Finalmente um furo 1,9 cm (3 / 4 ") de distância do meio círculo, mas ainda dentro da área do prato. Esta será a porta para recarga de nitrogênio líquido (LN ₂₎ se os níveis de queda, enquanto imagem. Esta área de transferência serão encaminhados como a "tela de visualização" (Fig 1c).

2. Preparação da Amostra

1. Diluir células log fase de levedura cultivadas em sintético completa (SC) de mídia a uma concentração adequada de 1x10 ⁶ células / mL em água.
2. 2 mL da levedura diluída são pipetados em um R2 / 1 400 mesh de carbono revestido de cobre holey Cryo-EM grade (SPI Supplies, West Chester, PA) e permitiu a absorver por 15 segundos.
3. Blot afastado o excesso de líquido da superfície da grade tocando na parte de trás da grade para um pedaço de tecido de celulose moles (Kimwipe) por 2 segundos.
4. Se necessário, a grade pode ser lavado com 3 gotas l de água (1-3 vezes), e maus longe como no passo 3 por blotting da parte de trás.
5. Antes da lavagem final, a amostra é carregado no freezer mergulhar pneumático ea grade pendurado é lavado como no passo 2.4. Depois de mata-borrão a grade com lenço de papel rasgado (Kimwipe) para remover a maioria da água da superfície, a grade é mergulhado em lN ₂ etano líquido resfriado e transferido para uma caixa de crio-grade para armazenamento Nota ^1:. É importante deixar uma camada de líquido o mais fino possível na superfície para manter a amostra hidratada. Indevido blotting vão quer secar a amostra ou deixar de gelo que é opaca para o feixe de elétrons.

3. Cryo-Light Microscopy

1. Preencha o estágio criogênico comlN ₂ e cobrir rapidamente com a tela de carregamento (área de transferência de plástico com um único 1,9 cm (3 / 4 ") buraco).
2. Uma vez que o metal atinge lN temperatura _2, transferir a caixa crio grade por meio de 1,9 cm (3 / 4 ") buraco da tela de carregamento e na transferência de montagem criada pela 3 parafusos descrito na A5 parte. Desaperte a caixa de crio-grade de seu titular e remova o suporte para um melhor acesso. Mantenha a caixa de titular crio grade sob lN ₂ em um dewar separadas até a etapa 3.10. A caixa de crio-grade também devem ser mantidos sob lN ₂ a prevenir o aquecimento grade amostra.
3. . Recarga lN ₂ no estágio criogênico para logo abaixo do topo do dissipador de calor de alumínio Nota: lN _dois níveis devem ser verificados periodicamente e recarregado durante o processo de imagem para garantir lN ₂ é continuamente em contato com o dissipador de calor. Em geral, a recarga ocorre a cada 10 minutos através da porta de preencher a tela de visualização.
4. Pré-cool ponta da pinça em lN _2, em seguida, transferir sua grade (s) sobre a superfície de visualização plana do dissipador de calor de alumínio, com uma pinça, usando o 1.9 cm (3 / 4 ") buraco da tela de carregamento.
5. Mover cuidadosamente o crio-estágio para debaixo aberturas objetivo do microscópio de luz refletida.
6. Coloque a tela de visualização transparente no topo da tela de carregamento. Em seguida, lentamente, remova a tela de carregamento, deslizando-lo debaixo do ecrã de visualização. Nota: Neste ponto, a amostra é mais vulneráveis. Todas as correntes de ar ao redor do microscópio deve ser minimizada, incluindo: respiração, uma abertura de porta próxima, as pessoas passando, etc Sugerimos vestindo uma máscara ou pendurando uma viseira transparente abaixo do oculares do microscópio como medida de precaução.
7. Gire a lentes objetivas no ambiente frio de nitrogênio gás do crio-estágio e digitalização para a amostra na área de visualização plana do dissipador de calor. Usando o padrão brilhante luz de microscopia de campo foco técnicas no grid com um objectivo de baixa ampliação para encontrar o centro e ter uma imagem panorâmica. Especificações sobre as lentes de microscopia de luz utilizada para este experimento estão listados na seção Materiais Experimental. Nota: lN _dois não entram em contato com as lentes objetiva e ainda temos de ver a degradação de imagens ou dano às lentes dos efeitos do resfriamento .
8. Foco em alta ampliação em uma área de interesse e adquirir dados com campo claro, campo escuro, luz polarizada ou imagens de fluorescência. Certifique-se de registrar a localização da área de interesse na imagem de baixo campo ampliação brilhante para a correlação de futuro. Se todas as precauções listados acima para a recarga do lN _dois são seguidos, então a pressão positiva a partir do nitrogênio evaporação é suficiente para manter um ambiente livre de contaminação (independente da umidade ambiente) para a duração da imagem.
9. Uma vez terminado, substituir a tela de carregamento, deslizando-a sobre a parte superior da tela de visualização. Remova a tela de visualização, diminuindo deslizando-a por baixo da tela de carregamento.
10. Remover o estágio crio a partir do microscópio e com pré-resfriada pinças, transferir a grade de volta para a caixa de crio-grade. Parafuso do titular caixa crio grade em crio-grade caixa para selar contra o meio ambiente e transferência do titular para um dewar LN2 para armazenamento e imagem futuro.

4. Cryo-Electron Microscopy

1. Seguintes técnicas padronizadas e estabelecidas, carregar a grade de amostra em um suporte de transferência de crio-EM, mantendo a amostra à temperatura de nitrogênio líquido em todos os momentos.
2. Insira o crio titular com grade de exemplo em um Microscópio Eletrônico de Transmissão.
3. Em uma visão de ampliação adequado baixo (50-500x de ampliação nominal), encontrar o centro da grade de amostra.
4. Use o previamente coletadas baixa ampliação crio LM-dados a partir do passo 3.7 para determinar a orientação relativa das abas da rede de cobre da central (como descrito na Figura 2) e identificar áreas de interesse para exata correlação.
5. Prosseguir com o alinhamento microscópio, baixa dose de crio-EM de imagem e de coleta de dados.

5. Resultados representante

O estágio criogênico (Fig 1a) é uma maneira eficaz de reunir crio-LM de dados para crio-fluorescência microscopia e análise cryo-LM/cryo-EM correlativos. A Figura 2 mostra como a combinação de baixa e alta ampliação crio-LM imagens permite construir mapas de referência que direcioná-lo para áreas específicas em crio-EM. O resultado crio-LM mapa de referência (Fig. 2b) foi utilizado durante a Cryo-EM aquisição de dados para localizar as regiões exata mostrada na Figura 3.

Figura 1. Stage criogénicos. A) A disposição do palco criogênico consiste de uma caixa de transferência de crio-grade montagem indicada wseta om um branco e um dissipador de calor de alumínio. Grids são transferidos sob lN ₂ da caixa de crio-grade e colocado diretamente sobre a área de visualização do dissipador de calor como indicado pela seta preta. B) Imagem representando o estágio criogênico com carga tela. O buraco na tela de carregamento é colocado diretamente sobre a crio-grade caixa de montar e funciona como uma porta para transferir as amostras e para o transporte de amostras a partir da caixa crio-grade para a área de amostra visualização no dissipador de calor com uma pinça. C) O criogênicos estágio na posição sob as lentes objetivas com a tela de visualização no lugar. O recorte especial na tela de visualização permite que as lentes objetivo de facilitar a troca na posição sem mover o estágio criogênico. O buraco na tela de visualização de distância da área de amostra funciona como um lN _dois preencher porto para reabastecer lN ₂ níveis, se necessário.

Figura 2. Navegando em crio-LM para estudos correlativos. A) baixa ampliação vista crio LM-de células de levedura aderiram a uma grade de amostra. B) A mesma imagem em (a) revestidas com uma imagem de alta ampliação de fluorescência de uma área de interesse e com um polígono preenchido laranja que marca o centro da grade da amostra. O centro é composto de um grupo de quatro quadrados, três tendo um guia de metal extra e o quarto aberto. Para os três quadrados com uma guia de metal extra, dois pares de partes do guia sobre os eixos longo e curto formando um centro assimétrico. Este centro assimétrico pode ser visto no canto superior esquerdo e foi usado para indicar o ângulo de rotação e lateralidade da grade entre crio-LM e crio-EM. Áreas de uma imagem de baixa ampliação muitos dos juros pode ser marcada e usada como um mapa de referência para localizar áreas idênticas em crio-EM. C) A imagem ampliada de fluorescência crio-LM da área de interesse em (b). HTA1-PCP, um c-terminal marcador PCP histona, pode ser visto como uma estrutura verde punctate rotulagem a localização do núcleo. D) Uma imagem Cryo-EM da área correspondente em (c). Barras de escala representam 50 microns.

Figura 3. Correlação de crio-LM e crio-EM. Dois campos de vista mostrando células de levedura idênticos correlacionada com crio-brilhante campo (um d), crio-fluorescência (b, e), e crio-EM (c, f bares). Scale representam 5 microns.

Discussão

Usando nosso estágio criogênico e técnicas de preparação de amostras, estudos correlativos entre crio-LM e crio-EM apresentam várias vantagens sobre as abordagens tradicionais temperatura ambiente, incluindo mas não limitados a: fixação rápida ^1,2, Reduziu fotobranqueamento ³, E digitalização de integridade da amostra antes da Cryo-EM ^4,5 Ou químico de fixação / incorporação ⁶. Um dos gargalos para a coleta de dados Cryo-EM é o tempo necessário para ambos transferir a amostra para um TEM e digitalização da rede para encontrar regiões adequadas para a imagem. Com a aquisição crio-LM de dados rápida ⁵, O tempo gasto encontrar células boas pode ser bastante reduzido. Assim, podemos economizar tempo e dinheiro e mitigar esse gargalo de pré-digitalizar e mapeamento de áreas de interesse em crio-LM.

Mais caros ou complexos estágios criogênico pode permitir que imagens de alta resolução crio-LM. No entanto, o estágio fabricados aqui é mais do que adequado para muitas aplicações. Se crio-LM de imagem e transferências grade de amostragem são realizadas com cautela, como descrito no texto e vídeo, totalmente livre de contaminação de imagens pode ser realizado. Este método permite correlação direta de dados de microscopia fluorescente e eletrônica de uma mesma célula, organela ou complexo macromolecular dispersos sobre o suporte de carbono ou contidos dentro de uma secção de tecido fino ⁷. Note-se que o valor deste estágio criogênico se estende para além cryo-LM/cryo-EM estudos correlatos ao campo da microscopia de luz como um todo. Nesta fase criogênica é bem adequado para ambas as amostras delicada e corantes fluoróforo / manchas ⁸, Pontos quânticos, ou proteínas fluorescentes marcados ⁹ Que pode ficar instável durante o quarto fixação química de temperatura e incorporação com glutaraldeído e paraformaldeído. Como resultado, esperamos que esta fase criogênica irá fornecer maior acesso aos interessados ​​em crio-LM, que tenham sido previamente dissuadido por um acesso de custos e insuficiente.

Solução de problemas Cryo-Light Microscopy

1. Amostra de adsorção: Amostras diferentes podem apresentar características variáveis ​​de adsorção ao suporte de carbono. Você pode achar que é necessário usar outros tipos de redes de apoio, tais como carbono contínuo, holey de carbono, ou formvar grades revestidas de apoio amostra. Além disso, se a amostra é vinculativo para as barras de cobre da rede e não a superfície do carbono, pode ser necessário ajustar a química da superfície de carbono incubando a grade com um agente umectante ou por descarga glow antes da adição da amostra.

2. Estabilidade palco: Se você notar vibrações, é provável devido ao estágio da amostra que está sendo sobrecarregado com o peso do que o borbulhamento de LN2. O peso adicional do estágio criogênico, às vezes pode causar vibrações de baixa freqüência para transmitir ao longo do estágio do microscópio padrão de 3 eixos, viagens e afetar negativamente a imagem através de indefinição. Isto pode ser facilmente corrigido através do apoio a etapa do microscópio de viagens de baixo ou com uma mini-lift-ajustável ou um adaptador ajustável com duplo parafuso braços, como mostrado no vídeo. Esses dois mecanismos de apoio ajustável interagir com uma porção não-móveis da etapa de viagem e, portanto, ainda permite eixos X e Y-tradução, conforme necessário para geração de imagens.

Materiais

Tabela de reagentes e equipamentos específicos:

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome	Companhia	Catalogo	Comentários	Custo
1-22,86 cm (9 ") pan pizza com borda inclinada	Cozinhe bem		Mercearia local	$ 4,39
1-22,86 cm (9 ") bandeja de bolo	Cozinhe bem		Mercearia local	$ 4,93
4 pares de pauzinhos			Mercearia local	$ 0,50
1 - Grandes Coisas espuma em spray	Great Stuff		Loja de ferragem local	$ 5,98
1 - 4 centímetros x8cm x1cm bloco de alumínio			Loja de ferragem local ou depósito de sucata de metal	$ 10,00
5 - # 10 1,91 centímetros (3 / 4 ") de cabeça chata parafusos com fenda w / porcas			Loja de ferragem local	$ 0,98
3 - # 4 0,95 centímetros (3 / 8 ") ranhurada parafusos w / porcas			Loja de ferragem local	$ 0,98
15 - # 10 arruelas			Loja de ferragem local	$ 0,98
2 - transparente pranchetas de plástico			Loja escritório local	$ 6,84
1 - caixa porta-Cryo-EM grade	Ted Pella	160-41		N / A
1 - Cryo-EM grade de vara de manipulação de caixa	Ted Pella	160-46		N / A
1 - R2 / 1 filme de carbono holey, 400-malha de cobre da rede de apoio Cryo-EM	Suprimentos SPI	4340C-XA		N / A

Materiais experimentais

1. Cepa de levedura: Hta1-PCP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-PCP:: KanMX6 do laboratório Kaplan na UC Davis).
2. Cryo-Light Microscopy: imagens Cryo-luz de microscopia foram tiradas em um microscópio Leica DM4000M refletindo com uma Leica DFC310 FX CCD da câmera. Campo brilhante, campo escuro e imagens de fluorescência foram adquiridas usando um HCX PL FLUOTAR 5x 0,15 NA objetivo de ar, um HCX PL FLUOTAR 10x 0,30 NA objetivo de ar, um PL FLUOTAR 50x 0,55 NA objetivo de ar ou um NPLAN 100x 0,75 NA objetivo ar. Campo vivas e imagens de campo escuro usada uma lâmpada de tungstênio 12V 100W como fonte de luz. Para fluorescência, uma fonte EL6000 lâmpada UV foi usada em conjunto com um JC1 Leica (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF 535/40 BP & LP 580) Cube Filter.
3. Cryo-Microscopia Eletrônica de Transmissão: Cryo-EM imagens foram obtidas em um Microscópio Eletrônico de JEM-2100-FEG de transmissão (JEOL, Japão), operando em 200 KeV utilizando um Gatan 626 titular crio transferência (Gatan, EUA). Micrografias foram registradas em ampliações nominal de 50, 200, 1.200 e 4.000 X em um 4096 x 4096 pixels Tietz câmera CCD (TVIPS, Gauting, Alemanha).