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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Criar modelo de mouse semelhante ao SOP
NOTA: Os camundongos usados neste estudo eram de fundo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e foram mantidos com comida e água ad libitum em um ciclo claro/escuro de 14/10 h a 24 °C.
- Preparação de pellets DHT
- Tubo de autoclave silastic para esterilizar. Corte os tubos de silastic com um comprimento de 15 mm com uma lâmina de barbear.
- Sele um lado injetando silicone adesivo médico no tubo com uma agulha embotada de 20 G presa a uma seringa de 3 mL. O êmbolo deve ser retirado da seringa e, em seguida, o adesivo inserido no reservatório. O êmbolo é reinserido e o adesivo empurrado para baixo até começar a emergir da agulha. A agulha embotada é feita cortando o lado da ponta afiada da agulha de 20 G com uma tesoura forte. O comprimento do silicone no tubo deve ser superior a 2 mm para permitir o corte pós-produção.
- Seque durante a noite; verifique se há bolhas de ar no lado selado. Aqueles sem bolhas de ar são usados para pellets DHT. Outros podem ser usados para pellets de controle sem DHT.
- Use luvas, máscara, óculos de proteção e jaleco antes de fazer pellet de DHT em um capuz para evitar a exposição do DHT à pele.
- Deitar o pó de DHT num recipiente de pesagem de plástico e pressionar o lado aberto dos tubos com tampa adesiva (produzidos em 1.1.1) no pó de DHT.
- O pó de DHT pode ser compactado com um grande clipe de papel que é endireitado. Continue até que o DHT atinja uma altura de 4 mm (ou comprimento desejado). Verifique o comprimento do DHT com uma régua e sele o lado aberto com silicone, seque durante a noite.
- Corte cada lado selado para fazer o comprimento do silicone de 2 mm de comprimento. O comprimento total do pellet será de 8 mm.
- Sele ambos os lados da tubulação de silastic vazia como pellet de controle (no-DHT).
- Mantenha os pellets em um tubo cônico de 50 mL envolto em papel alumínio (para evitar a exposição à luz) em temperatura ambiente até o uso. Os pellets de DHT mantêm a eficácia total por pelo menos 3 meses de armazenamento.
- Inserção e substituição de DHT
- Até 20 pastilhas de DHT ou pastilhas de controlo são submersas separadamente num tubo cónico de 50 ml com 30 ml de soro fisiológico estéril a 0,9% durante 24 h a 37 °C para equilíbrio imediatamente antes da inserção.
- Antes da cirurgia, as superfícies e luvas são desinfetadas com clidol e as superfícies de trabalho são cobertas com papel absorvente limpo com suporte de plástico (almofada cirúrgica). Todos os instrumentos que entram em contato com os animais são descontaminados antes de entrar no biotério por autoclavagem. Os instrumentos serão deixados secar e esfriar antes do uso.
- São usados camundongos fêmeas de 2 meses de idade (4–5 camundongos/gaiola). Os camundongos são injetados por via intraperitoneal com xilazina (3,5 mg / kg de peso corporal) e cetamina (78,8 mg / kg de peso corporal) usando uma seringa de insulina. Os cálculos para mistura e dosagem de anestesia estão na Tabela 1.
- Depois que a anestesia adequada for alcançada, medida pela perda do reflexo do dedo do pé e respiração lenta, o camundongo será preparado para a cirurgia.
- Desinfete a pele da área com betadina usando gaze estéril e limpe com etanol a 70%. A área será novamente pintada com betadine.
- Faça um furo de cerca de 5 mm de comprimento com uma tesoura sob a pele perto do pescoço. Com um trochar de 10 G, fazer um pequeno túnel (15 mm) no sentido rostral. O pellet é inserido dorsalmente com o trochar.
- A abertura é então selada com adesivo cirúrgico. Aproxime manualmente as bordas da ferida com uma pinça e pinceladas suaves para aplicar uma fina película de adesivo líquido nas bordas aproximadas da ferida. Acumule 3 camadas finas de adesivo para garantir que o adesivo seja distribuído uniformemente sobre a ferida. O adesivo deve se estender 1 cm de cada lado das bordas da ferida opostas. Clipes de sutura ou cirúrgicos também podem ser usados para fechar o orifício. Coloque os ratos de volta na gaiola, alojados individualmente, com uma almofada térmica para recuperação. Substitua o pellet a cada 4 semanas para manter um nível constante de exposição a andrógenos. O pellet original será removido e um novo pellet será inserido conforme descrito acima, em uma posição semelhante.
| Cetamina
(100 mg/ml)
| xilazina
(100 mg/ml)
| salino
(0,9%)
|
| 175 μL | 15 μL | 810 μL |
| Injeção intraperitoneal de solução de trabalho: 0,1 mL/20g de peso corporal |
Tabela 1. Coquetel de cetamina / xilazina.