$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Alojamento básico de ratos
- Alojar os ratos em gaiolas de plástico com fundo e laterais sólidas e uma camada de cama macia e material de nidificação, como trituração de papel. Use roupas de cama compostas de espigas de milho picadas ou aparas de madeira e certifique-se de que a roupa de cama seja trocada regularmente para higienização.
- Forneça acesso a comida e água ad libitum. A parte superior da gaiola de plástico abriga um funil de comida. Dispense pellets de ração para ratos devidamente formulados da tremonha de alimentos e forneça um dispensador de água. Certifique-se de que a parte superior da gaiola possui um filtro de ar para proteger os ratos de contaminantes externos.
- Mantenha os ritmos circadianos naturais dos camundongos seguindo um ciclo claro-escuro de 12 horas na instalação habitacional. Realize testes comportamentais no mesmo horário do dia, idealmente durante o ciclo escuro do animal, como durante a noite.
nota: Deve-se tomar cuidado para distinguir os ratos no alojamento. Vários métodos para distinguir camundongos estão disponíveis, como socos na orelha, marcas na orelha e marcas na cauda.
2. Teste do labirinto de Barnes: construção
- Obtenha uma tábua circular de madeira com 120 cm de diâmetro.
- Corte 20 orifícios circulares (4,5 cm de diâmetro) ao redor do perímetro do círculo. Posicione cada buraco a 2,5 cm de distância da borda do labirinto e a 13 cm de distância dos buracos vizinhos.
- Alise as superfícies e pinte-as de branco brilhante (recomenda-se uma cor brilhante).
- Designe um lado do tabuleiro do labirinto para inserção de pequenos ganchos de copo a cerca de 2–3 cm de distância de cada um dos 20 orifícios e coloque dois ganchos para cada orifício (um de cada lado de cada orifício).
- Use discos pretos rasos (plástico) para cobrir buracos na lateral do labirinto com ganchos. Use ganchos para prender elásticos grossos para segurar os discos na parte inferior do labirinto.
- Monte com segurança o labirinto Barnes 120 cm acima do solo e longe de outros objetos igualmente altos, como mesas ou cadeiras. Uma caixa ou banquinho pode ser usado para apoiar o meio do labirinto.
- Coloque grandes pôsteres brancos com uma forma em cada parede (triângulo, círculo e cruz) como dicas extra-labirinto em 3 lados do labirinto. Mantenha os pôsteres nas paredes ao redor do labirinto para cada teste.
- No último lado do labirinto, monte uma cortina preta sólida para esconder os observadores para que os dados possam ser registrados com precisão sem que os pesquisadores sejam visíveis para os ratos no labirinto.
- Suspenda uma câmera de vídeo sobre a arena com uma visão panorâmica de toda a superfície do labirinto.
- Limpe todas as superfícies do labirinto (discos pretos e caixa alvo incluídos) com água e depois uma solução de etanol a 70% antes e depois de cada teste com camundongos.
- Coloque uma fonte de luz de 100 W 25 cm acima do centro do labirinto (ligue/desligue no início/fim do teste) e certifique-se de que os discos e ganchos estejam voltados para o chão.
nota: Todas as outras luzes do teto da sala devem ser desligadas durante o teste. Recomenda-se a adição de um gerador de ruído ultrassônico pendurado próximo a uma luz de 100 W. Ligue/desative-o no início/fim de cada teste.
3. Teste do labirinto de Barnes: Procedimento
NOTA: Certifique-se de que todos os componentes do labirinto sejam limpos com água e solução de etanol a 70% antes e depois de cada teste, permitindo que o tempo seque completamente antes que o teste seja retomado. Certifique-se de ter materiais de limpeza prontos, bem como cronômetros para os testes.
- Alojar todos os ratos em grupos usando um método de identificação confiável. Mantenha os ratos fora da sala de testes quando não estiverem correndo ativamente no labirinto. Isso é para garantir que eles não sejam submetidos ao gerador de ruído ultrassônico prematuramente.
- Manuseie os ratos pegando-os e segurando-os suavemente pela base da cauda, com as patas mantidas na mão.
- Para o treinamento, faça com que os ratos corram no labirinto diariamente uma vez por dia durante 7 dias seguidos para avaliar o aprendizado/aquisição.
nota: Um único teste de longo prazo pode ser feito em uma data posterior para avaliar a memória/retenção. O protocolo atual treinou camundongos adolescentes a partir do 32º dia pós-natal e um estudo de longo prazo foi realizado em adultos aos 4 meses de idade.
- Atribua aleatoriamente cada mouse a um orifício alvo para usar durante todo o período de teste. Os buracos podem ser rotulados de 1 a 20 na parte inferior do labirinto ou na parte externa do perímetro do labirinto, onde não são visíveis para o mouse no labirinto.
- Substitua o disco de orifício atribuído por uma pequena caixa preta (23 x 11 cm). Prenda-o firmemente ao labirinto de Barnes usando elásticos conectados aos ganchos mais próximos.
nota: A caixa de destino é rasa o suficiente para que o mouse possa descer facilmente nela ou contém uma etapa para garantir que o mouse não precise pular para dentro dela.
- Coloque o mouse no centro do labirinto embaixo de um copo para aclimatar por 30 segundos até o início do teste. Comece a gravar o vídeo.
- Ligue a luz e o noisemaker ultrassônico. Levante o copo por meio de um mecanismo de corda para evitar polarizar o rumo inicial do animal. Inicie um cronômetro e sente-se atrás da cortina para observar.
- Depois que o mouse entrar no orifício alvo, cubra o orifício com o mesmo copo opaco usado no início do teste ou um fichário e desligue o criador de ruído ultrassônico. Se o mouse não tiver entrado no alvo após 5 minutos, encurrale o mouse no orifício do alvo.
- Certifique-se de que o mouse entre no orifício. Quando o mouse estiver dentro da caixa de destino, cubra o buraco e desligue o gerador de ruído. Deixe o mouse permanecer na caixa de destino por 1 minuto sem ser perturbado.
- Embora o orifício alvo permaneça constante para cada mouse durante todo o período de treinamento, execute os mouses em uma ordem aleatória a cada dia para garantir que eles não estejam seguindo nenhuma pista/cheiro deixado pelo mouse anterior.