Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Indução SE
- Compre camundongos C57BL/6NHsd machos de 8 semanas e pese cada camundongo. Em seguida, use uma caneta marcadora para marcar as caudas de todos os camundongos para facilitar sua identificação durante a indução SE.
- Calcule a quantidade de brometo de metila escopolamina (escopolamina; 2 mg/kg), hemissulfato de terbutalina (terbutalina; 2 mg/kg) e cloridrato de pilocarpina (pilocarpina; 280 mg/kg) com base no peso do camundongo e adicione solução salina (NaCl 0,9%, 10 mL/kg) para fazer as soluções.
NOTA: Por exemplo, se o peso do camundongo for de 25 g, as seguintes quantidades são aplicadas: Escopolamina e terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, Solução salina: 10 mL/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL, Pilocarpina: 280 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 7 mg, Solução salina: 10 mL/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL.
- Coloque a mistura de escopolamina e terbutalina em uma seringa de 1 mL com uma agulha de 30 G. Injete a solução por via intraperitoneal em cada camundongo e, em seguida, retorne os camundongos às suas gaiolas. Aos 30 minutos após a administração de escopolamina e terbutalina, injete a solução de pilocarpina em cada camundongo (i.p.; seringa de 1 mL; agulha de 30 G). Imediatamente após a injeção de pilocarpina, coloque os camundongos em uma incubadora (28–30 ° C) para observação.
- Monitore cuidadosamente o comportamento dos camundongos até que o SE seja induzido. Se forem detectadas convulsões motoras límbicas que correspondem ao estágio 3 ou superior de acordo com a escala de Racine, registre o tempo e monitore os camundongos para determinar se as convulsões ocorrem com mais frequência. Quando as convulsões motoras contínuas durarem mais de 2 minutos, coloque o camundongo em uma nova gaiola em temperatura ambiente e mantenha o monitoramento por 3 h para determinar se suas convulsões continuam e se o SE é induzido. Eutanasiar os camundongos que não conseguiram entrar no SE cerca de 2 h após a injeção de pilocarpina.
NOTA: Escala de Racine; estágio 1, movimento bucal e facial; estágio 2, acenando com a cabeça; estágio 3, clônus do membro anterior; estágio 4, criação com clônus do membro torácico; estágio 5, elevação e queda com clônus do membro anterior. Se o camundongo não for transferido para a gaiola em temperatura ambiente imediatamente após a indução de SE, o camundongo pode morrer devido à hipertermia.
- Interrompa as convulsões agudas comportamentais 3 h após o início do SE injetando solução de diazepam (i.p.; 10 mg / kg; seringa de 1 mL; agulha 30 G). Fazer a solução de diazepam diluindo 5 mg/mL de diazepam em óleo de rícino hidrogenado polioxil 35 a 10% com adição de soro fisiológico (i.p.; 10 mL/kg; seringa de 1 mL; agulha 30 G).
NOTA: Solução de óleo de rícino hidrogenado polioxil 35 a 10%: 1 mL de solução de óleo de rícino hidrogenado polioxil 35 + 9 mL de solução salina. Armazene a solução em temperatura ambiente. Por exemplo, se o peso corporal do camundongo for de 25 g, injete 250 μL de solução de diazepam: 50 μL 5 mg / mL de diazepam + 200 μL de solução de óleo de rícino hidrogenado polioxil 35 a 10% = 250 μL 1 mg / mL de diazepam.
- Para camundongos simulados, execute uma injeção i.p. da mistura de brometo de metila escopolamina e hemissulfato de terbutalina (i.p.; ambos 2 mg/kg, 10 mL/kg; seringa de 1 mL; agulha 30 G). 30 min depois, injete a solução salina por via intraperitoneal (i.p.; 10 mL/kg; seringa de 1 mL; agulha 30 G).
NOTA: Se o peso corporal do camundongo for de 25 g, injete 250 μL de solução salina em vez de pilocarpina.
- Após a injeção de diazepam (i.p.; seringa de 1 mL; agulha 30 G), administrar 1 mL de dextrose a 5% por camundongo individual (i.p.; seringa de 1 mL; agulha 26 G).
NOTA: 1 mL de injeção de dextrose a 5% fornece fonte de energia e hidratação que pode aumentar a taxa de sobrevivência.
- Durante o pós-tratamento na incubadora (28–30 °C), limpe as secreções excessivas, como saliva, lágrimas e fezes.
- No dia 1 após a indução de SE, pesar os camundongos e mantê-los na incubadora (28–30 °C) por mais um dia. No dia 2, após a indução de SE, pese os camundongos e devolva-os à gaiola de origem. Forneça ração úmida para facilitar sua recuperação.
NOTA: Neste experimento, a taxa de mortalidade para C57BL / 6NHsd após o término do SE foi de 8,57% em média (3 de 35 camundongos testados).
- Medir o peso corporal diário dos animais até 7 dias pós-pilocarpina e injetar nos camundongos dextrose a 5% (i.p.; seringa de 1 mL; agulha 26 G) quando o peso corporal não tiver aumentado. Pare o monitoramento do peso corporal quando os camundongos começarem a recuperar o peso corporal e consuma ração úmida sem dificuldade 2 dias após a injeção de pilocarpina.
NOTA: Se o peso corporal de um camundongo não aumentou até 7 dias após o SE, exclua o camundongo do experimento e faça a eutanásia com dióxido de carbono. Dependendo do histórico do rato, a morte pode ocorrer ocasionalmente; no entanto, no caso de C57BL / 6NHsd, menos de 1% dos camundongos morreram nesses experimentos. Com sobrevida de mais de 7 dias após a indução do SE, os camundongos raramente morrem durante o período latente.
