Direcionamento de nanopartículas funcionalizadas do câncer de ovário: uma técnica para facilitar a absorção do agente de contraste de nanopartículas conjugadas com ácido fólico por células de câncer de ovário

Resumo

Fonte: Lusk, J. F. et al. Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústica. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para facilitar a internalização de nanopartículas de sulfeto de cobre (CuS NPs) com cobertura de ácido fólico. As NPs CuS funcionalizadas com ácido fólico têm a capacidade de atingir os receptores de folato que são superexpressos em muitas células de câncer de ovário.

Protocolo

1. Síntese e Funcionalização de Nanopartículas

CUIDADO: Toda a síntese deve ocorrer em uma capela de exaustão química ventilada.

1. Antes da síntese, filtre aproximadamente 300 mL de água deionizada (DI) através de um filtro estéril de 0,2 μm.
2. Limpe um balão de vidro de fundo redondo de 250 ml com uma solução detergente e lave com água DI. Adicione 0,0134 g de CuCl₂ em 100 mL de água DI para criar uma solução de 1 mM.
3. Adicione 0,015 g de ácido fólico (FA) à solução de CuCl₂ e mexa por ~ 5 min usando uma barra de agitação magnética.
4. Adicione Na₂S·9H₂O (0,024 g em 100 μL de água DI) por aproximadamente 10 s à mistura de reação utilizando uma pipeta de 200 μL.
   nota: Após a adição do Na₂S·9H₂O, a solução mudará de cor de amarelo claro para marrom escuro.
5. Tampar a reação e colocar em banho de óleo, regulado para 90 °C, e continuar agitando com uma barra de agitação magnética. Após aproximadamente 15 min, ou quando o banho de óleo atingir 85−90 °C, deixe a reação prosseguir por mais uma hora. Sua mistura deve gradualmente se transformar em uma cor verde escura.
   nota: Certifique-se de ventilar o sistema enquanto aquece a mistura de reação para evitar o acúmulo de pressão.
6. Remova o recipiente de reação do banho de óleo e deixe esfriar brevemente em temperatura ambiente por aproximadamente 10 a 15 minutos antes de transferir para um banho de gelo.
7. Uma vez que a mistura de reação tenha esfriado abaixo de 20 ° C, ajuste o pH para 10 utilizando 1M NaOH para dissolver o ácido fólico restante em solução.
8. Purificar a mistura de reacção FA-CuS utilizando uma coluna de centrifugação de 30 kDa. Adicionar a solução em lotes de 15 ml à coluna e centrifugar a 3.082 x g durante 15 min.
9. Uma vez concentrada toda a mistura de reação, recombinar as frações concentradas e lavar 4x com 15 mL de NaOH pH 10 na coluna de centrifugação de 30 kDa.
10. Para medições de massa, pegue 1/3 da solução (~ 66 μL) e divida em três frascos de vidro. Secar em estufa a vácuo durante a noite a 40 °C sob vácuo de ~27 mmHg.
11. Dissolver os outros 2/3 da solução concentrada em 250 μl de PBS e conservar a 4 °C até nova utilização.
12. Antes de utilizar os NPs FA-CuS, sonicá-los por 30 min em um sonicador de banho em alta configuração.

2. Captação de NPs FA-CuS por células de câncer de ovário

1. Antes da incubação com NPs FA-CuS, incube as células SKOV-3 em um frasco T75 com 8-15 mL de meio RPMI-1640 livre de ácido fólico com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina por pelo menos 24 h.
2. Semeie as células em 0,5 mL de meio de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico a uma densidade de 0,1 x 10⁶ células/mL em uma placa de 24 poços.
3. No dia seguinte, incubar as células com 400 μg/mL de FA-CuS NPS em 0,5 mL de meio de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico por 2 h.
4. Após esta incubação, tripsinizar as células com 0,5 mL de tripsina a 0,25% com EDTA. Adicione pelo menos 1 mL de meio de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico para neutralizar a tripsina e centrifugue as células a 123 x g por 6 min.
5. Remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 2 mL de PBS e centrifugue a 123 x g por 6 min. Execute esta etapa de lavagem 2x para remover quaisquer NPs não ligados.
6. Ressuspenda as células em 1−2 mL de PBS com solução de Tween a 2%.
7. Conte as células usando um hemocitômetro e Trypan Blue. Além disso, dilua as células se a contagem de células for muito alta. Diluir as células em PBS com 2% de Tween até a concentração escolhida para detecção.
8. As células agora estão prontas para serem analisadas pelo sistema PAFC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,025% de tripsina com EDTA	Corning	25-053-CL
Filtros centrífugos Amicon Ultra-15	Millipore	UFC903024
Filtros centrífugos Amicon Ultra-4	Millipore	UFC803024
Hematocitômetro Bright-Line	Hausser Científico	1492
Cloreto de cobre (II)	ACROS ORGÂNICOS	206532500
Banho de limpeza ultrassônica digital da série CPX	Marca de pescador	Modelo CPX3800
Seringas Norm-Ject 10 mL	HENKE LOBO ATREVIDO	4100-X00V0
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
ácido fólico	Sigma-Aldrich	Rolamento F7876-10G
Pbs	Alfa Aesar	J62036
Penicilina estreptomicina	GIBCO	15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) Sem Ácido Fólico	Gibco	Rolamento 27016-021
Células SKOV-3	ATCC	HTB-77
Grânulos de hidróxido de sódio	BDH	BDH9292-500G
Sulfeto de sódio não hidratado	Sigma-Aldrich	Rolamento 431648-50G
Solução Trypan Blue 0,4%	Amresco	K940-100ML
Filtro de seringa estéril de 0,2 μm	VWR	Rolamento 28145-477
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1.8KG	Detergente utilizado para a limpeza de vidraria.
Pré-adolescente 20	Sigma-Aldrich	Rolamento P7949-100ML