Isolamento mitocondrial: uma técnica para isolar mitocôndrias de amostra de tecido de câncer de ovário humano

Resumo

Fonte: Zhan, X. et al. Preparação de mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário e tecidos ovarianos de controle para análise proteômica quantitativa. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve o procedimento para isolar mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário humano usando centrifugação de velocidade diferencial em combinação com centrifugação por gradiente de densidade. As mitocôndrias isoladas podem ser usadas para análise proteômica do proteoma mitocondrial do câncer de ovário humano.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação de mitocôndrias a partir de tecidos de câncer de ovário humano

Amostras de tecido ovariano, incluindo tecidos de câncer de ovário (n = 7) foram usadas para este protocolo.

1. Prepare 250 mL do tampão de isolamento mitocondrial misturando 210 mM de manitol, 70 mM de sacarose, 100 mM de cloreto de potássio (KCl), 50 mM de Tris-HCl, 1 mM de ácido diamina tetracético (EDTA), 0,1 mM de ácido etilenoglicol bis(2-aminoetílico éter) tetracético (EGTA), 1 mM de inibidor de protease de fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF), 2 mM de ortovanadato de sódio (V) e 0,2% de albumina de soro bovino (BSA), pH 7,4.
2. Coloque ~ 1,5 g de tecidos de câncer de ovário em um prato de vidro limpo.
3. Adicione 2 mL do tampão de isolamento mitocondrial pré-resfriado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido 3x.
4. Use uma tesoura oftálmica limpa para picar totalmente o tecido em cerca de 1 mm^{e 3} pedaços e transfira os tecidos picados para um tubo de centrífuga de 50 mL.
5. Adicione 13,5 mL de tampão de isolamento mitocondrial contendo 0,2 mg / mL de nagarse e, em seguida, use um homogeneizador elétrico para homogeneizar (use escala 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) os tecidos picados (2 min, 4 ° C).
6. Adicione mais 3 mL de tampão de isolamento mitocondrial nos homogeneizados de tecido e misture-os bem por pipetagem.
7. Centrifugar o homogeneizado de tecido preparado (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Remova a fração nuclear bruta (ou seja, o pellet) e mantenha o sobrenadante.
8. Centrifugar novamente o sobrenadante (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Remova os microssomas (ou seja, o sobrenadante) e guarde o pellet.
9. Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial e ressuspenda bem o pellet por pipetagem leve.
10. Centrifugar a suspensão de pellets (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Descarte o sobrenadante e guarde as mitocôndrias brutas (ou seja, o pellet).
11. Adicione 12 mL de meio gradiente de densidade de 25% (ou seja, Nycodenz) para ressuspender as mitocôndrias brutas extraídas.
12. Faça um gradiente de densidade descontínuo enchendo um tubo de baixo para cima com 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas da etapa 1.11), 8 mL de 23% e 3 mL de meio de gradiente de densidade de 20% e centrifugue-o (52.000 x g, 90 min, 4 ° C).
13. Use uma seringa longa e romba para coletar as mitocôndrias purificadas na interface entre o meio de gradiente de densidade de 25% e 30% em um tubo limpo.
14. Adicione tampão de isolamento mitocondrial às mitocôndrias coletadas para diluí-las em um volume triplo. Centrifugue (15.000 x g, 20 min, 4 °C) e descarte o sobrenadante.
15. Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial para ressuspender o pellet e a centrífuga (15.000 x g, 20 min, 4 ° C). Rejeitar o sobrenadante e guardar o sedimento.
16. Colete o pellet final (ou seja, as mitocôndrias purificadas) e armazene-o a -20 °C.
    nota: Combine todas as mitocôndrias purificadas do tecido do câncer de ovário como amostra de mitocôndrias para análise proteômica quantitativa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido diamina tetracético (EDTA)	sigma	798681-100G	Anidro, de fluxo livre, Redi-Dri, ≥98%
TDT	sigma	10197777001	1,4-Ditiotreito
Ácido etilenoglicol bis(2-aminoetílico éter)tetracético (EGTA)	sigma	E0396-10G	BioXtra, ≥97,0%
Homogeneizador	Agitação silenciosa	HYQ-3110
Centrífuga de alta velocidade de baixa temperatura	Eppendorf	5424R
centrifuga	XiangYi	TDZ4--WS
manitol	Macklin	M813424-100G	O manitol é um poliol (álcool poli-hídrico) produzido a partir da hidrogenação da frutose que funciona como adoçante, umectante e agente de volume. Possui baixa higroscopicidade e baixa solvência de óleo.
Inibidor da protease do fluoreto de fenilmetanossulfonila (PMSF)	Solarbio	P0100-1ML	O PMSF é um inibidor de protease que reage com resíduos de serina para inibir tripsina, quimotripsina, trombina e papaína.
Cloreto de potássio	Macklin	P816354-25G	O cloreto de potássio, KCI, também conhecido como muriato de potássio e silvita, é um sólido cristalino incolor com sabor salgado que derrete a 776 ° C (1420 OF). É solúvel em água, mas insolúvel em álcool. O cloreto de potássio é usado em fertilizantes, produtos farmacêuticos, fotografia e como substituto do sal