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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação de mitocôndrias a partir de tecidos de câncer de ovário humano
Amostras de tecido ovariano, incluindo tecidos de câncer de ovário (n = 7) foram usadas para este protocolo.
- Prepare 250 mL do tampão de isolamento mitocondrial misturando 210 mM de manitol, 70 mM de sacarose, 100 mM de cloreto de potássio (KCl), 50 mM de Tris-HCl, 1 mM de ácido diamina tetracético (EDTA), 0,1 mM de ácido etilenoglicol bis(2-aminoetílico éter) tetracético (EGTA), 1 mM de inibidor de protease de fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF), 2 mM de ortovanadato de sódio (V) e 0,2% de albumina de soro bovino (BSA), pH 7,4.
- Coloque ~ 1,5 g de tecidos de câncer de ovário em um prato de vidro limpo.
- Adicione 2 mL do tampão de isolamento mitocondrial pré-resfriado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido 3x.
- Use uma tesoura oftálmica limpa para picar totalmente o tecido em cerca de 1 mme 3 pedaços e transfira os tecidos picados para um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Adicione 13,5 mL de tampão de isolamento mitocondrial contendo 0,2 mg / mL de nagarse e, em seguida, use um homogeneizador elétrico para homogeneizar (use escala 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) os tecidos picados (2 min, 4 ° C).
- Adicione mais 3 mL de tampão de isolamento mitocondrial nos homogeneizados de tecido e misture-os bem por pipetagem.
- Centrifugar o homogeneizado de tecido preparado (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Remova a fração nuclear bruta (ou seja, o pellet) e mantenha o sobrenadante.
- Centrifugar novamente o sobrenadante (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Remova os microssomas (ou seja, o sobrenadante) e guarde o pellet.
- Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial e ressuspenda bem o pellet por pipetagem leve.
- Centrifugar a suspensão de pellets (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Descarte o sobrenadante e guarde as mitocôndrias brutas (ou seja, o pellet).
- Adicione 12 mL de meio gradiente de densidade de 25% (ou seja, Nycodenz) para ressuspender as mitocôndrias brutas extraídas.
- Faça um gradiente de densidade descontínuo enchendo um tubo de baixo para cima com 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas da etapa 1.11), 8 mL de 23% e 3 mL de meio de gradiente de densidade de 20% e centrifugue-o (52.000 x g, 90 min, 4 ° C).
- Use uma seringa longa e romba para coletar as mitocôndrias purificadas na interface entre o meio de gradiente de densidade de 25% e 30% em um tubo limpo.
- Adicione tampão de isolamento mitocondrial às mitocôndrias coletadas para diluí-las em um volume triplo. Centrifugue (15.000 x g, 20 min, 4 °C) e descarte o sobrenadante.
- Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial para ressuspender o pellet e a centrífuga (15.000 x g, 20 min, 4 ° C). Rejeitar o sobrenadante e guardar o sedimento.
- Colete o pellet final (ou seja, as mitocôndrias purificadas) e armazene-o a -20 °C.
nota: Combine todas as mitocôndrias purificadas do tecido do câncer de ovário como amostra de mitocôndrias para análise proteômica quantitativa.