Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Criação de linhagem celular VX2 in vitro
- Colha o tumor VX2 do músculo quadríceps de coelho e crescimento no flanco do camundongo.
- Descongele os blocos tumorais VX2 congelados (1 cm x 1 cm), pique em uma placa de cultura usando uma lâmina de bisturi e passe por um filtro de 70 μm adicionando pequenas quantidades de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) sequencialmente para garantir que todas as células sejam filtradas para um volume final de 1 mL.
- Conte as células e dilua com solução salina tamponada com fosfato a 0,9% até uma concentração de 1 x 107/mL e coloque no gelo em um tubo estéril.
nota: Os blocos tumorais foram obtidos de um colaborador de laboratório da propagação prévia de tumores VX2 em músculos quadríceps de coelho.
- Anestesie uma coelha branca da Nova Zelândia (peso 2,5-3,5 kg) com isoflurano inalado a 2-5%, remova o pelo que cobre o local da injeção e limpe o local da injeção com solução de iodopovidona. Injetar 500 μL da suspensão de células VX2 preparada (5 x 106 células/ml) no músculo quadríceps do coelho. Monitore o coelho clinicamente quanto ao crescimento do tumor a partir do dia 10.
- Eutanásia dos coelhos depois que os tumores atingirem 1-1,5 cm de diâmetro (medido externamente com paquímetros) usando um método aprovado pelo veterinário. Confirme a eutanásia verificando os sinais vitais, incluindo frequência cardíaca e respiratória. Extirpar o tumor usando instrumentos estéreis após limpar a área com solução de betadina.
- Em um armário de segurança biológica usando instrumentos estéreis, pique o tumor em pedaços pequenos (0,2 cm) em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm usando uma lâmina de bisturi. Passe os fragmentos tumorais por um filtro de células de 70 μm usando 1 mL de HBSS, conforme descrito na etapa 1.1.1. Conte as células e dilua usando solução salina a 0,9% para obter 7,5 x 105 células em 200 μL.
- Anestesiar camundongos gama NOD SCID machos (peso 25 g) usando isoflurano a 4% a 1 L/min e manter a anestesia com isoflurano a 2%. Uma vez que os camundongos estejam anestesiados, injete 200 μL da solução da etapa 1.1.5 no tecido subcutâneo do flanco do camundongo usando uma agulha de calibre 27.
- Colheita e passagem de células VX2 in vitro
- Monitore o crescimento do xenoenxerto clinicamente duas vezes por semana até que os tumores atinjam 1 cm de diâmetro usando paquímetros.
- Eutanásia de camundongos colocando-os em uma câmara de CO2 ou realizando luxação cervical após anestesia com gás isoflurano a 4%. Extirpar tumores em condições estéreis em um gabinete de segurança biológica.
- Pique os tumores com bisturi em pedaços de 1-2 mm em uma placa de cultura de tecidos de 6 cm contendo 3 mL de meio de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham'ss F12+ 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Deixe os fragmentos do tumor intactos em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 por dois dias até que as células comecem a crescer a partir dos pedaços do tumor. Posteriormente, verifique as placas cultivadas diariamente por microscopia de luz para confluência celular. Ao atingir 70% de confluência, tripsinizar as células adicionando 1 mL de tripsina a 0,05% ao frasco e colocando-as de volta na incubadora a 37 °C por 5 min.
- Neutralize a tripsina com 6 mL de meio DMEM/Ham'ss F12 + 10% de FBS, colete as células e centrifugue a 4 °C por 5 min a 300 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3,5 mL de novo meio DMEM/Ham'ss F12 + 10% FBS. Placas revestidas com colágeno I fresco de 6 cm com 1,6 x 106 células por placa para atingir aproximadamente 50% de densidade de semeadura celular.
NOTA: 50% de densidade celular refere-se às células que ocupam 50% da área de superfície da placa quando conectadas.
- Passagem precoce: Repita o processo acima (tripsinização, semeadura) até que as células tenham sido passadas 5 vezes e, em seguida, avalie a pureza da linha celular com PCR usando um ensaio de PCR quantitativo para distinguir o DNA genômico de coelho do DNA genômico de camundongo (consulte a etapa 1.3.1-1.3.4).
nota: Após 8 passagens, as células podem ser propagadas em placas de cultura de tecidos aderentes regulares não revestidas com colágeno.
- Passagem, tripsinizam e congelam alíquotas de células em DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO a uma concentração de 2 x10,6 por frasco. Armazene as células em nitrogênio líquido até que seja necessário para experimentos.
- Confirmação da origem VX2 das células sobreviventes:
- Crie uma cura padrão a partir de DNA genômico purificado de camundongo e coelho (Etapa 1.3.2 e Etapa 1.3.3). Use primers que visam sequências específicas de espécies dentro do segundo quadro de leitura aberto do elemento retrotransposon LINE-1.
nota: As sequências de primers para CRPV E6 são: 5's- GATCCTGGACCCAACCAGTG e 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Foram utilizados os elementos de retrotransposon LINE-1. As sequências de primers para LINE-1 de coelho são: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC e 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT As sequências de primers para LINE-1 de camundongo são: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG e 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- Para criar uma curva padrão para CRPV E6, purifique o lisado de células tumorais VX2 (Etapa 1.1.1) usando um kit comercial seguindo o protocolo do fabricante. Quantifique esse DNA usando um ensaio comercial. Realize 6 diluições seriais de 225 pg/μL a 0,925 pg/μL em tampão EDTA-TE baixo. Para criar uma curva padrão para DNA genômico de camundongo, dilua 100 μg de DNA genômico comercial de camundongo em tampão EDTA-TE baixo em 5 diluições de 125 pg/μL até 0,0125 pg/μL.
- Colocar 4 μL de cada solução diluída das amostras do passo 1.3.2 nos alvéolos e executar as amostras num termociclador de PCR. Use os valores de Cq de cada corrida junto com as quantidades de DNA por poço para calcular uma curva padrão usando as configurações de limite automático do software termociclador.
- Use procedimentos padrão de qPCR para realizar PCR com 40 ciclos de ciclo de 2 etapas (98 °C e 60 °C) em um termociclador. Estabeleça valores limite e defina valores delta Ct em >35 para garantir que haja contaminação mínima de camundongos na linhagem celular VX2 de coelho. O volume total de cada reação foi de 10 μL, consistindo de 5 μL de 2x Mastermix, 1 μL de primers direto + reverso com concentração final de primer em reação a 250 nM e 4 μL de amostra de DNA.
nota: Os valores limite são estabelecidos e os valores delta Ct são fixados em >35 para garantir que haja contaminação mínima do camundongo na linhagem celular VX2 do coelho. O nível recomendado de DNA VX2 para detecção confiável por qPCR é de 1 a 10 pg.
2. Cultura de células VX2 e criação de suspensão celular
- Descongele os frascos contendo células VX2 (congeladas na etapa 1.2.7) em banho-maria a 37 ° C por 1 minuto e transfira as células para um tubo de centrífuga cônico com 10 mL de meio de cultura (1: 1 DMEM / F-12 + 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina). Centrifugar durante 8 min a 107 x g, rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento celular em 9 ml de meio.
- Transferir as células ressuspensas para um balão de cultura grande. Incubar as células sem agitar a 37 °C. Verificar diariamente as células quanto à confluência utilizando microscopia de luz e mudar os meios de cultura de três em três dias.
- Criação de células VX2 cultivadas em suspensão injetável
- Tripsinize as células adicionando 3 mL de tripsina a 0,25% ao frasco assim que as células atingirem 80% de confluência. Colocar o balão na incubadora (37 °C) durante 5 min. Transfira a solução para um tubo de centrífuga cônico e centrifugue por 8 min a 107 x g e depois remova o sobrenadante.
- Lave os grânulos celulares 3 vezes com 9 mL de solução salina tamponada com fosfato, centrifugue e remova o sobrenadante como acima. Conte as células e dilua com solução salina tamponada com fosfato a 0,9% até uma concentração de 4 x 107 células / mL e coloque em um tubo de centrífuga cônico estéril no gelo.
- Criação de suspensão injetável de células VX2 propagadas in vivo
- Descongelar os blocos tumorais VX2 congelados (1 cm x 1 cm), picar numa placa de cultura com uma lâmina de bisturi e coar através de um filtro de 70 μm, como no passo 1.1.1. Adicione pequenas quantidades de HBSS sequencialmente para garantir que todas as células sejam filtradas para um volume final de 1 mL. Conte as células e dilua com solução salina tamponada com fosfato a 0,9% até a concentração de 1 x107/mL e coloque no gelo em um tubo estéril.
nota: Os blocos tumorais foram obtidos de um colaborador de laboratório da propagação prévia de tumores VX2 em músculos quadríceps de coelho.
3. Estabelecimento do Modelo Cirúrgico
- Estabelecimento da anestesia cirúrgica e preparo pré-operatório
- Pré-medicar coelhos brancos fêmeas da Nova Zelândia (2,5-3,5 kg) 1 h antes do procedimento cirúrgico planejado usando injeções de acepromazina (1 mg / kg IM) e meloxicam (0,2 mg / kg SQ). Anestesie uma coelha branca da Nova Zelândia (peso 2,5-3,5 kg) com isoflurano inalado a 2-5%, remova o pelo que cobre o local da injeção e limpe o local da injeção com solução de iodopovidona.
- Intubar coelhos anestesiados usando uma máscara laríngea (MLA) e fixá-los no lugar com fita adesiva, mantendo a anestesia profunda titulando a dose de isoflurano inalatório entre 2-5%. Monitore a anestesia cirúrgica regularmente durante todo o procedimento, verificando os sinais vitais (frequência respiratória, enchimento capilar, saturação de oxigênio, se disponível) e monitorando sinais sugestivos de dor (movimento, retirada de estímulos, ruídos) ou anestesia leve (movimento, mastigação do tubo da ML).
nota: Isso deve ser feito por alguém com experiência em monitorar anestesia cirúrgica.
- Coloque um cateter de veia da orelha de calibre 22 na veia dorsal marginal. Administre cefazolina (20 mg/kg) por via intravenosa 10 minutos antes da incisão cirúrgica na pele.
- Prenda o cabelo sobre a pélvis e o abdômen antes de colocar o coelho na mesa de operação e, em seguida, coloque-os em posição dorsal na mesa de operação. Limpe o campo cirúrgico usando uma preparação cirúrgica da pele em 3 etapas (sabonete betadina, solução de clorexidina, solução betadina). Cubra o campo cirúrgico com campos de laparotomia após marcar a parte superior do osso púbico, deixando uma área de 5 cm x 5 cm da parte inferior do abdome exposta.
- Confecção da incisão de laparotomia e identificação dos cornos uterinos
- Coloque uma touca cirúrgica e uma máscara facial. Esfregue as mãos usando clorexidina ou solução cirúrgica de betadine. Usando a técnica estéril, coloque um avental estéril e luvas cirúrgicas estéreis.
- Usando um bisturi de lâmina # 11, faça uma incisão de 2,5 cm de comprimento 1 cm cranial à sínfise púbica através da pele e do tecido subcutâneo do abdômen do coelho. Incise a fáscia do reto e disseque os músculos retos lateralmente para expor o peritônio subjacente. Entre no peritônio nitidamente depois de garantir que a superfície inferior esteja livre de intestinos ou outros órgãos abdominais.
- Localize os cornos uterinos identificando a bexiga urinária e varrendo um dedo enluvado superior, posterior e lateralmente sobre o ápice da bexiga.
nota: Se necessário, a bexiga cheia pode ser esvaziada usando pressão digital. Uma vez localizado, traga os cornos uterinos através da incisão abdominal para descansar na parede abdominal.
- Usando uma sutura absorvível trançada 3-0, execute uma única ligadura de sutura de cada corno uterino aproximadamente 1,5-2,0 cm distal aos colos do útero. Coloque a sutura medial às artérias uterinas, que correm ao longo da face lateral de cada chifre. Amarre as suturas confortavelmente para ocluir os cornos uterinos distais (Figura 1).
- Inoculação miometrial VX2
- Usando uma agulha de calibre 27, injete 0,5 mL da suspensão de células VX2 previamente preparada da etapa 2.3.2 (para o modelo VX2 cultivado) ou 2.4 (para o modelo VX2 propagado in vivo) no miométrio de cada corno uterino proximal ao local da sutura (entre o local da sutura e o colo do útero). Injete por mais de 1 minuto e certifique-se de que as células não estejam sendo injetadas na cavidade uterina subjacente. Anestesie os animais usando isoflurano inalado (2-5%) e uma máquina anestésica com circuito Bain.
- Aplique pressão no local da injeção do miométrio por 30 s após a injeção para minimizar o vazamento de células. Inspecione os locais de injeção e sutura quanto à hemostasia e coloque os cornos uterinos de volta no abdômen.
- Fechando a incisão cirúrgica
- Fechamento profundo da parede abdominal: Identifique o ápice da incisão peritoneal e segure o peritônio, o músculo reto e a fáscia com uma pinça de tecido.
- Para fazer isso, ancore a sutura em um ápice da incisão, suturando superficial a profundo de um lado da incisão e profundo a superficial do outro. Dê um nó. Usando a sutura anexada, faça pontos perpendiculares à incisão através das camadas da parede abdominal, trabalhando passo a passo ao longo da incisão de um lado para o outro. Amarre a sutura e corte.
- Fechamento superficial da parede abdominal: Identifique o ápice da incisão da pele e suture a pele abdominal usando sutura de polifilamento absorvível subcuticular 3-0 enterrada. Aplique cola cirúrgica na incisão fechada para se opor às bordas da pele.
- Para fazer isso, ancore a sutura em um ápice da incisão, suturando profundamente a superficial de um lado da incisão e superficial a profunda do outro. Dê um nó. Usando as suturas anexadas, faça pontos corridos na camada dérmica paralela à incisão, trabalhando passo a passo ao longo da incisão de um lado para o outro. Amarre a sutura e corte.
- Cuidados pós-operatórios
- Despertar da anestesia: Desligue o isoflurano assim que a incisão estiver fechada e deixe o coelho respirar oxigênio pela máscara enquanto monitora os sinais de despertar (por exemplo, movimentos espontâneos, abertura dos olhos e movimentos de mastigação nas vias aéreas da máscara laríngea). Extube o coelho assim que esses sinais forem observados e forneça oxigênio por máscara e um cobertor quente até que os coelhos estejam alertas e capazes de se sentar de forma independente.
- Monitoramento pós-operatório: Monitore os coelhos duas vezes ao dia por 4 dias e diariamente por mais 10 dias após a cirurgia. Monitorar, avaliar seu estado geral, ingestão de alimentos e água, débito urinário e fecal, avaliação da dor, peso, sinais vitais (frequência cardíaca, frequência respiratória) e local da cirurgia em busca de inchaço, eritema, secreção ou deiscência.
- Controle da dor pós-operatória: Administre Meloxicam diariamente (0,2 mg/kg SQ) por 48 h no pós-operatório e depois conforme necessário com base na avaliação da dor. Administre buprenorfina imediatamente no pós-operatório e a cada 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) por 24 h e depois conforme necessário com base na avaliação da dor
- Antibióticos (enrofloxacina 5mg / kg IM) podem ser administrados diariamente durante sete dias após a cirurgia para prevenir infecção da ferida, conforme recomendado pelo seu veterinário. Administre fluidos subcutâneos (15 mL de SQ) duas vezes ao dia, conforme necessário para desidratação, e alimentos moles ou outros suplementos dietéticos são fornecidos diariamente, conforme necessário para perda de peso.
