Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Configurando e incubando a lâmina tratada com ITO para coculturas
- Coculturas indivisas
- Liquidificar a agarose a 70 °C numa chapa quente.
- Coloque o divisor de 8 poços em cima da lâmina tratada com tinóxido de índio (ITO) (Figura 1A). O fundo de borracha na divisória ajuda na adesão à corrediça, mas certifique-se de aplicar uma pressão suave e contínua para baixo durante o revestimento de agarose para garantir que não haja vazamento ou mistura entre os poços.
- Colete as células em um tubo cônico de 15 mL, centrifugue (5 min a 800 rpm) e ressuspenda para 50k células por 150 μL em 1x meio DMEM. Se uma densidade celular diferente for ideal, certifique-se de que, nesta etapa, a suspensão celular seja 2x a densidade final desejada (por exemplo, para uma concentração final de 50.000 células em 300 μL, a densidade celular nesta etapa é de 50.000 células em 150 μL).
- Antes de plaquear a cultura de células, adicione o explante ovariano ao centro do poço (Figura 1B).
- Adicione agarose a cada cultura de células em tubos individuais de 2 mL antes do plaqueamento. Para cada alvéolo, combinar 200 μL de suspensão celular e 200 μL de agarose liquefeita em um tubo de 2 mL. Por exemplo, para quatro poços, combine 800 μL de suspensão celular e 800 μL de agarose a 2%. Alguma mistura sobrará, mas fazer um pouco mais do que o necessário evita bolhas de ar durante a pipetagem.
- Adicione agarose a culturas de células individuais imediatamente antes de plaquear essa cultura de células. A agarose esfriará em menos de um minuto, então esteja preparado para empratar rapidamente.
- Adicione imediatamente 300 μL da mistura célula / agarose a cada poço ( Figura 1C ). A Figura 1C mostra três condições de células e uma condição de meio, cada uma com e sem ovário.
- Incube a lâmina a 37 °C e 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada.
- Coculturas divididas
- Corte divisórias de plástico fino e liso (Figura 2A).
nota: Este experimento usa as laterais de uma bacia de mídia descartável estéril porque são planas e finas. Corte-os apenas o suficiente para caber perfeitamente na hipotenusa do poço (~ 13 mm).
- Liquidificar a agarose a 70 °C numa chapa quente.
- Coloque o divisor de 8 poços no topo da lâmina tratada com ITO (Figura 2B). O fundo de borracha na divisória ajuda na adesão à corrediça, mas certifique-se de aplicar uma pressão suave e contínua para baixo durante o revestimento de agarose para garantir que não haja vazamento ou mistura entre os poços.
2. Lâmina de secagem e preparação para MALDI-TOF MS
- Após quatro dias (ou qualquer ponto de tempo preferido), remova o divisor da câmara dos plugues de agarose e da lâmina (Figura 1D). Separe suavemente as laterais da agarose da câmara com uma espátula plana e puxe suavemente a câmara para cima, tomando cuidado para não mover os plugues de agarose. Se eles se moverem, reposicione-os suavemente para que não se toquem.
- Coloque a lâmina em um forno a 37 °C por aproximadamente 4 horas, girando 90° a cada hora.
nota: A rotação da lâmina é importante para garantir uma distribuição uniforme do calor em toda a amostra.
- Depois de seco, retire a lâmina do forno (Figura 1E).
- Aplicar solução matricial utilizando o pulverizador (Figura 1F), com os seguintes parâmetros: temperatura = 30 °C, vazão = 0,2 mL/min, número de passadas = 8, direção = CC e distância do bico = 40 mm.
nota: Em vez de um pulverizador de matriz, um aerógrafo artístico pode ser usado para aplicar a matriz líquida. A mesma solução de matriz pode ser usada para pulverizar, mas é necessário aproximadamente o dobro da solução. Com a lâmina presa de forma que fique pendurada verticalmente, borrife a lâmina em um ângulo de 90° a aproximadamente trinta centímetros de distância até que a camada da matriz fique visível.
- Adicione 1 μL de calibrante (Fósforo Vermelho para alvos <500 Da, uma mistura de peptídeos (consulte a Tabela de Materiais) para alvos <5.000 Da) para limpar manchas na lâmina. O vermelho de fósforo não requer mistura com a matriz, mas a mistura de peptídeos requer mistura 1:1 com a matriz para ajudar na ionização. Aguarde o calibrante secar.
- Desenhe um X usando um marcador permanente em cada canto do slide e tire uma imagem óptica usando uma câmera ou um scanner a 1.200 dpi.
