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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Síntese de Núcleo de Nanoestrela de Ouro
NOTA: As nanoestrelas de ouro são usadas como núcleos para ambos os tipos de nanossondas SERRS usadas neste experimento.
- Preparar 800 ml de solução de ácido ascórbico (C6H8O6) a 60 mM em água desionizada (DI) e 8 ml de solução de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) a 20 mM em água DI. Resfrie a 4 °C.
- Efectuar esta etapa de reacção a 4 °C. Colocar um balão cónico contendo 800 ml da solução de ácido ascórbico numa placa de agitação magnética e induzir um vórtice constante. Adicione rapidamente 8 mL da solução de ácido tetracloroáurico no vórtice. Em segundos, as nanoestrelas se formarão e a solução assumirá uma cor azul escura. Se a cor a qualquer momento se tornar rosa ou roxa, significando a formação de nanoesferas, a suspensão deve ser descartada e a síntese repetida
.
- Despeje a suspensão nanostar em tubos cônicos de 50 mL e centrifugue por 20 min (4 ° C, 3.220 x g). Aspirar o sobrenadante deixando cerca de 200 μL da solução em cada tubo. Preste atenção para não perturbar o pellet de nanopartículas no fundo do tubo.
nota: O sobrenadante deve ter uma tonalidade azul por causa das nanoestrelas suspensas restantes.
- Usando uma micropipeta, agite a solução para suspender e coletar as nanopartículas de cada tubo. Parte do pellet pode ser compactada no fundo do tubo e não ressuspenderá mesmo com pipetagem vigorosa – descarte esta peça.
- Transferir a suspensão de nanopartículas para um de diálise (MWCO 3,5 kDa) e dialisar por pelo menos três dias contra 2 L de água DI, trocando a água diariamente. Armazene nanoestrelas em diálise a 4 °C por até um mês com trocas de água a cada 3-4 dias.
nota: As nanoestrelas devem ser mantidas em diálise até serem necessárias para a reação de sílica, conforme descrito na secção 2.
2. Formação da Casca de Sílica
NOTA: Dois sabores de nanossondas Raman são sintetizados. O procedimento de síntese é o mesmo para ambos, com a única diferença sendo a molécula repórter Raman (corante) usada. Neste experimento, o perclorato IR780 e o IR140 são usados. A reação deve ser sempre realizada em recipientes plásticos. A síntese é altamente escalável e pode ser ajustada para a quantidade desejada de injetado necessária. Aqui, é descrita uma síntese de batelada média, que pode ser dimensionada linearmente para volumes menores ou maiores, conforme necessário, com as mesmas concentrações e tempos de reação. As reações para os dois tipos de nanossonda SERRS podem ser realizadas em paralelo. Preste atenção para evitar contaminação cruzada. A sonicação deve ser realizada para a redispersão de pellets de nanopartículas após centrifugação durante as etapas de lavagem ou após as nanopartículas terem sido armazenadas por mais de uma hora. A sonicação deve ser realizada até que as nanopartículas estejam claramente suspensas na solução, normalmente por 1 s.
- No tubo A (um tubo cônico de 50 mL), misture 10 mL de isopropanol, 500 μL de TEOS, 200 μL de água DI e 60 μL de corante (perclorato de IR780 ou IR140, 20 mM em DMF (dimetilformamida)).
- No tubo B (um tubo cônico de 15 mL), misture 3 mL de etanol e 200 μL de hidróxido de amônio. Sonicar as nanoestrelas da Etapa 1.4 para dispersar quaisquer aglomerados em solução e adicionar 1,2 mL de nanoestrelas ao tubo.
NOTA: a solução de hidróxido de amônio é altamente volátil e difícil de pipetar com precisão. Armazene-o a 4 °C, até que seja necessário, para facilitar a pipetagem.
- Coloque o tubo A em um misturador de vórtice e induza um vórtice constante. Adicione rapidamente o conteúdo do Tubo B no vórtice e continue misturando por cerca de 5 s. Transfira imediatamente para um shaker e deixe-o reagir por 15 min enquanto agita a 300 rpm, em temperatura ambiente.
- Após a incubação de 15 minutos, extinguir a reação adicionando etanol para encher o tubo de 50 mL. Centrifugue por 20 min a 3.220 x g e 4 °C.
- Aspire o sobrenadante, deixando cerca de 0,5 mL de solução, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Adicione 1 mL de etanol e agite com uma pipeta para ressuspender as nanopartículas. Transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e lave 4 vezes com etanol centrifugando a 11.000 x g por 4 min, aspirando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet por ultrassom por aproximadamente 1 s.
- NOTA: Nesta fase, as nanopartículas silicatadas podem ser funcionalizadas, conforme descrito na secção 3, ou ressuspensas em água DI com uma etapa de lavagem extra, para armazenamento a 4 °C durante uma semana.
3. Funcionalização de superfície
NOTA: As nanossondas IR780 SERRS serão conjugadas com anticorpos direcionados ao receptor de folato por meio de um reticulador PEG para formar αFR-NPs; As nanossondas de controle IR140 SERRS serão conjugadas com uma monocamada passivante de PEG, para nt-NPs. Ambos os sabores são formados por meio de uma reação tiol-maleimida em reações separadas, mas paralelas.
- Lave as nanopartículas duas vezes centrifugando a 11.000 x g por 4 min, aspirando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet em 1 mL de etanol por ultrassom. Repita a etapa de lavagem mais uma vez, mas redisperse em 1 mL de etanol a 85%, 10% de 3-MPTMS (3-mercaptopropiltrimetoxissilano) e 5% de água DI. Incube à temperatura ambiente por 1-2 h para introduzir tióis na superfície da partícula.
- Lave as nanopartículas funcionalizadas com tiol centrifugando a 11.000 x g por 4 min, aspirando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet por ultrassom, duas vezes em etanol, duas vezes em DI e, finalmente, em tampão HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico) (10 mM, pH 7,1) e reserve.
- NOTA: Deve ser usado tampão MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico) ou HEPES. Tampões com maior salinidade, como PBS (solução salina tamponada com fosfato), podem induzir a agregação de nanopartículas.
- Para os αFR-NPs funcionalizados com anticorpos, reagir 200 μg de anticorpos (clone de anticorpo de proteína de ligação antifolato [LK26]) com excesso molar dez vezes maior de reticulador PEG (poli(etilenoglicol)(N-hidroxisuccinimida 5-pentanoato) éter N′-(3-maleimidopropionil) aminoetano (CAS: 851040-94-3), em dimetilsulfóxido (DMSO)) em 500 μL de tampão MES (10 mM, pH 7,1) por 30 min.
- Remova o excesso de reticulador e concentre o anticorpo centrifugando a solução de anticorpo-PEG em um filtro centrífugo (MWCO 100 kDa). Para os filtros centrífugos utilizados neste estudo, realizar centrifugação durante 10 min a 14.000 x g e 23 °C. Recuperar os anticorpos conjugados num tubo novo invertendo o filtro e centrifugando a 1.000 x g durante 2 min.
- Pipete as nanopartículas IR780 da Etapa 3.2 para o tubo com os anticorpos e agite com a pipeta para misturar. Incubar a mistura durante, pelo menos, 30 min à temperatura ambiente ou a 4 °C durante a noite para formar os αFR-NP.
- Para formar nt-NPs, adicione 1% p/v de metoxi-terminada (m)PEG5000-maleimida (CAS: 99126-64-4) dissolvida em DMSO às nanopartículas IR140 SERRS da Etapa 3.2 e deixe reagir em tampão MES de 500 μL (10 mM, pH 7,1) por pelo menos 30 min à temperatura ambiente, ou a 4 °C durante a noite.
- Para administração a camundongos (seção 4), gire os dois sabores de nanossonda a 11.000 x g por 4 min, aspire o sobrenadante para remover a solução com anticorpos livres não reagidos/PEG e redisperse cada sabor em tampão MES (10 mM, pH 7,1) em concentrações de 600 pM. Ao ressuspender as nanopartículas, minimize a exposição desnecessária ao ultrassom para evitar a desnaturação do anticorpo.
4. Injeção e imagem de Nanoprobe
- Preparar as nanossondas (αFR-NP e nt-NP) conforme descrito nas secções 1-3 e misturar numa proporção de 1:1, para uma concentração final de 300 pM de cada tipo em tampão MES (10 mM, pH 7,1). Opcionalmente, prepare padrões de referência de 30 pM de cada um dos sabores de nanossonda em tubos cônicos pequenos (100 μL).
- Injete intraperitonealmente 1 mL da suspensão de nanopartículas em cada camundongo e massageie suavemente a barriga para distribuir as nanopartículas dentro da cavidade peritoneal. Retorne o mouse ao seu alojamento. Após 25 ou mais minutos, eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2.
- Prenda o mouse em uma plataforma cirúrgica, em decúbito dorsal (para imagens de abdômen inteiro, a plataforma precisa ser montável no estágio de microscópio vertical).
- Usando pinças serrilhadas e tesouras de dissecção, remova a pele para expor o peritônio e faça uma grande incisão sagital (entre 2 e 3 cm de comprimento) para expor todo o abdômen. Prenda as abas peritoneais na plataforma. Lave o interior da cavidade peritoneal com pelo menos 60 mL de PBS usando um frasco plástico de esguicho.
NOTA: Para permitir a imagem desobstruída de todo o abdômen, os intestinos precisam ser mobilizados ou excisados. Para a excisão, ressecção com uma ligadura dos vasos mesentéricos para reduzir a hemorragia na cavidade abdominal.
- Como alternativa, para obter imagens de órgãos específicos, excise-os após a lavagem com PBS e coloque-os em uma lâmina de microscópio.
- Transferir a plataforma ou lâmina para um microespectrofotômetro Raman com configuração óptica vertical e uma platina motorizada para geração de imagens; utilizar um sistema comercial com laser de diodo de 300 mW e 785 nm, com grade de 1.200 ranhuras por mm, centrado em 1.115 cm-1.
- Concentre-se na área de interesse usando óptica de luz branca, parfocal com o laser Raman. Selecione a área a ser fotografada e a resolução desejada; Neste relato, foi utilizado um modo de aquisição de alta velocidade (espectros adquiridos sob iluminação contínua a laser com o estágio do microscópio em constante movimento, com resolução espacial efetiva de 14,2 μm por 200 μm; com aumento de 5x, potência de 100 mW na objetiva e exposição de <100 ms por ponto).
nota: Os tubos com as nanossondas de referência da Etapa 4.1 podem ser colocados dentro da área da imagem, se desejado, para fornecer padrões de referência internos para a análise subsequente. Certifique-se de que nenhuma fonte de luz estranha além do laser atinja a objetiva.
- Opcionalmente, prepare a amostra para processamento histológico e validação por fixação em paraformaldeído a 4% em PBS durante a noite a 4 ° C. Enxágue com PBS a 4 ° C por 15 min pelo menos duas vezes. Manter a amostra em etanol a 70% em água até o processamento histológico padrão e inclusão em parafina. Para validação histológica dos tumores, cortes (5 μm de espessura) de diferentes profundidades do bloco de parafina podem ser corados com hematoxilina e eosina (H&E).