Sistema de Cultura Proximal: Uma Técnica de Cultura In Vitro para Estudar a Sinalização Parácrina entre Células

Resumo

Fonte: Dasari, S. et al. Um método de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina entre células.J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, desenvolvemos um modelo de co-cultura proximal de células de câncer de ovário e células mesoteliais humanas primárias. Este modelo fisiologicamente relevante permite o estudo da sinalização parácrina, onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas enquanto evitam o contato celular direto.

Protocolo

A. Preparação de células

1. Isolamento e cultura de células mesoteliais primárias humanas
   1. Isole as células mesoteliais primárias humanas (HPMCs) do omento humano e cultive-as em um meio de crescimento completo [Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de vitaminas] a 37 °C e 5% de CO₂,
      nota: Os HPMCs são normalmente cultivados até 100% de confluência (Figura 1A).
2. Condições de crescimento de células de câncer de ovário
   1. Cultive células de câncer de ovário HeyA8 em meio de crescimento completo a 37 ° C e 5% de CO₂.
      nota: Use células HeyA8 crescidas até cerca de 80% de confluência ( Figura 1B ).

B. Cultura de células

1. Configuração da cultura proximal
   1. Use insertos Transwell para placas de 6 poços com uma membrana de policarbonato tratada com cultura de tecidos de 10 μm de espessura com poros de 0,4 μm (10⁸ poros/cm²) e uma área de crescimento de 4,67 cm². Se necessário, otimize para diferentes tamanhos de inserção, dimensionando o número de células semeadas de acordo com a área da superfície de crescimento. Aqueça o meio de crescimento completo, tripsina e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C antes de usar.
2. Preparando as inserções
   1. Para semear as células HeyA8 na superfície inferior da membrana da inserção, remova a inserção de sua embalagem usando uma pinça estéril e coloque-a invertida em uma placa de cultura estéril de 15 cm.
   2. Use um prato de 15 cm, pois tem profundidade para acomodar o inserto invertido, ou substitua-o por qualquer recipiente estéril apropriado. Dependendo do experimento, coloque o número necessário de inserções no prato de 15 cm.
   3. Rotule os três controles e três condições experimentais de acordo com um marcador na borda das inserções.
3. Preparando as células cancerígenas
   1. Para tripsinizar as células HeyA8 cultivadas a 80% de confluência em um frasco de 25 cm² (~ 2 x 10⁶ células), adicione 1 mL de tripsina (0,25%) por 40-60 s e neutralize a tripsina com 6 mL de meio de crescimento completo.
   2. Centrifugue as células a 500 x g à temperatura ambiente (RT) por 3 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de crescimento completo. Conte as células vivas usando o método de exclusão do corante azul de tripano.
4. Semeando as células cancerígenas
   1. Suspenda 100.000 células/mL de células vivas HeyA8 em meio de crescimento completo. Semeie cuidadosamente 80.000 células HeyA8 suspensas em 800 μL de meio de crescimento completo na parte inferior da inserção (que agora está voltada para cima, pois está invertida).
   2. Semeie as células para formar uma forma de cúpula para que as células permaneçam na inserção (Figura 1C). Comece do centro da membrana e mova-se para fora em círculos concêntricos enquanto pipeta lentamente. Evite ir mais de 3 mm da borda para evitar qualquer derramamento do meio.
      nota: O número de células semeadas dependerá da taxa de crescimento das células e da duração do experimento. O número de células HeyA8 semeadas para esta cultura proximal foi otimizado, e as células serão 80–90% confluentes no final do terceiro dia.
5. Fixação de células cancerígenas
   1. Cubra o prato de 15 cm e mova cuidadosamente o prato que contém as inserções para a incubadora de CO₂. É fundamental não interromper a queda do meio e das células no inserto nesta etapa. Deixe as células a 37 °C durante 4 h para permitir que as células cancerígenas se fixem à inserção.
6. Preparando as células mesoteliais
   1. Após cerca de 4 h, tripsinize os HPMCs cultivados a 100% de confluência em um frasco de 75 cm² (~ 4 x 10⁶ células) com 2 mL de tripsina (0,25%) por 1–2 min e neutralize a tripsina com 12 mL de meio de crescimento completo.
   2. Centrifugue as células a 500 x g em RT por 3 min, ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio de crescimento completo e conte as células vivas usando o método de exclusão do corante azul de tripano.
7. Semeando as células mesoteliais
   1. Suspenda 300.000 células/mL de HPMCs vivos em meio de crescimento completo. Adicione 2,5 mL de meio de crescimento completo fresco a cada poço de uma placa de 6 poços. Traga cuidadosamente o prato de 15 cm que contém as inserções para a tampa de biossegurança. Usando uma pinça estéril, vire o inserto e coloque-o no poço da placa de 6 poços de forma que fique na vertical, com as células HeyA8 presas à superfície inferior imersas no meio de crescimento completo ( Figura 1C ).
   2. Semear 450.000 HPMCs suspensos em 1,5 mL de meio de crescimento no interior das inserções com as células HeyA8 presas à superfície voltada para o fundo do poço (Figura 1C) ou a inserções sem células HeyA8 para os controles HPMC. Adicione 1,5 mL de meio de crescimento sem células aos controles HeyA8.
8. Aumentando a cultura proximal
   1. Deixe a cultura proximal crescer na incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% de CO₂ por 72 h. Se necessário, o meio pode ser reabastecido da seguinte forma.
      1. Para o interior do inserto, remova 750 μL e adicione 750 μL de meio de crescimento completo fresco.
      2. Para a parte externa do inserto (a placa de 6 poços), remova 1 mL e adicione 1 mL de meio de crescimento completo fresco. O 1 mL foi escolhido pela conveniência de trocar o meio em uma única etapa. Se desejado, 1,25 mL pode ser removido e substituído.

Resultados

Figura 1: Montagem do sistema de cultura proximal.(A) Este painel mostra células mesoteliais primárias humanas (HPMCs). (B) Este painel mostra células de câncer de ovário HeyA8. Barras de escala = 200 μm (A-B). (C) As células HeyA8 foram semeadas na superfície inferior de uma inserção transwell com poros de 0,4 μm. Uma vez que as célu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suporte permeável Transwell de 24 mm com inserção de membrana de policarbonato de poros de 0,4 μm	Corning (Costar)	3412	• Membrana de policarbonato translúcido de 10 μm de espessura. • Tratado para fixação ideal das células. • Embalou 6 inserções em uma placa de 6 poços, 4 placas por caixa. • A membrana deve ser corada para visibilidade da célula. • Esterilizado por radiação gama.
Placa de 6 poços	Corning (Falcão)	353046	Fundo plano, tratado com TC, estéril, com tampa
Prato de cultura de 15 cm	Corning (Falcão)	353025	Placa de cultura de células estéril tratada com TC
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicilina estreptomicina	Corning	30-002-CI
Aminoácidos não essenciais MEM	Corning (Cellgro)	25-025-CI
Pipetas			Qualquer marca está bem
Incubadora de CO2			Qualquer marca está bem
Gabinete de nível de biossegurança II			Qualquer marca está bem