Modelagem de metástase de câncer de ovário no revestimento da cavidade peritoneal: um método para estabelecer um modelo 3D in vitro do revestimento peritoneal

Resumo

Fonte: Peters, P. N. et al. Modelando os Primeiros Passos da Disseminação do Câncer de Ovário em uma Cultura Organotípica da Cavidade Peritoneal Humana. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos o desenvolvimento de um modelo tridimensional in vitro do revestimento da cavidade peritoneal. Essa cultura organotípica pode ajudar a investigar a adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Protocolo

1. Plaqueamento da cultura organotípica

1. Libere NOF (fibroblastos omentais normais) de um frasco de cultura^{de 75 cm 2} enxaguando com 10 ml de PBS seguido de 3 ml de tripsina a 0,25% / 25 mM EDTA por não mais de 5 min. Neutralize a tripsina com pelo menos 3 vezes o volume do meio de crescimento total.
2. Transfira as células tripsinizadas para um tubo cônico de 50 ml e gire para baixo a 0,5 g x 3 min. Remova o sobrenadante e traga as células de volta em 5 ml de meio de crescimento completo. Utilizar um contador de células para contar as células recuperadas do balão de cultura.
3. Dilua as células no volume apropriado de meio de crescimento completo para colocar 2.000-4.000 NOF por 100 μl em uma placa preta de fundo transparente de 96 poços. Adicione 0,5 μg/100 μl de colagénio I de cauda de rato à mistura celular antes de plaquear. Deixe as células assentarem a 37 °C em 5% de CO₂ num ambiente humidificado durante pelo menos 4 h ou até que as células adiram à superfície da placa.
4. Libertar HPMC (células mesoteliais humanas primárias) do balão de cultura utilizando os mesmos métodos descritos nas etapas 1.1 e 1.2. Dilua as células na quantidade apropriada de meio de crescimento completo para colocar 10.000-20.000 HPMC por 50 μl em cima do NOF já revestido com colágeno I em placas de 96 poços. Deixe as células assentarem a 37 °C em 5% de CO₂ num ambiente humidificado durante pelo menos 18 h antes de iniciar as experiências.
5. Cultura de células de câncer de ovário HeyA8 que expressam proteína fluorescente verde (GFP) em meio de crescimento total. As células de câncer de ovário HeyA8 são marcadas com fluorescência pela expressão de um vetor lentiviral que expressa o cGFP do copépode (pCDH-CMV-MCS-EF1). As células cancerígenas do ovário HeyA8 devem ser 80-90% confluentes no dia do uso (fase de crescimento logarítmico). Libertar as células da placa de cultura e contar utilizando os mesmos métodos descritos nos passos 1.1-1.2 para as células primárias.
6. Permita que as células cancerígenas do ovário se recuperem em meios de crescimento completos por 15-20 min a 37 ° C em um tubo cônico com a tampa frouxamente fechada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pbs	Fisher Científico	SH3001304
Pratos de cultura de 15 cm	BD Biociências	353025
DMEM com L-Glutamina	Corning	10-013-CV
Vitaminas MEM	Corning	25-020-CL
Aminoácidos não essenciais MEM	Corning	25-025-CI
Penicilina-estreptomicina	Corning	30-002-CI
shaker	Thermo-Fisher	MaxQ 4450
centrifuga	Eppendorf	Rolamento 5702
incubadora	Thermo-Fisher	Forma Série II Jaqueta de Água Incubadora de CO2 Modelo 3100
Tripsina EDTA, 1x (0,25%)	Corning	25-053-CI
Frascos T-75	BD Biociências	353136
Frascos T-175	BD Biociências	353112
Pontas de pipeta	Rainin	P2, P10, P20, P200 e P1000
Pontas de pipeta	Corning	Ponteiras filtradas P2, P10, P20, P200 e P1000
Contador de células	Invitrogen	condessa
Câmara de Contagem de Células Condessa Slides	Invitrogen	C10313
Mancha azul de tripano (0,4%)	Gibco	Rolamento 15250-061
Colágeno tipo I (cauda de rato)	BD Biociências	354236
Placa de 96 poços, fundo transparente, preto	BD Biociências	353219