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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Isolamento e Cultura de Células Estromais Primárias Não Transformada
- Coleta e preparação de tecidos humanos.
- Obtenha amostras de omento humano, 2 cm3, removidas durante uma cirurgia abdominal e mergulhe imediatamente o tecido em solução salina tamponada com fosfato RT (PBS) (Figura 1A). Um pedaço de omento de 3 cm x 2 cm normalmente produz 1 milhão de células mesoteliais humanas primárias (HPMC) e 200.000 fibroblastos humanos primários ou fibroblastos omentais normais (NOF).
- Gire o PBS em que o tecido foi imerso a 0,5 x g por 3 min o mais rápido possível após a coleta (< 2 horas em PBS) e transfira o tecido para 20 ml de PBS fresco em um tubo cônico de 50 ml. Corte o tecido em pedaços de 5 mm3 picando com bisturis em uma placa de cultura estéril de 15 cm de diâmetro (Figura 1B).
- Isolamento primário de células mesoteliais humanas
- Para isolar HPMC, transfira o tecido picado para tubos cônicos de 50 ml e aguarde 1 minuto para que os pedaços sólidos flutuem para o topo (Figura 1C e D). HPMC e glóbulos vermelhos (RBC) estarão presentes no líquido no fundo. Use uma pipeta para remover o líquido do fundo do tubo e colocá-lo em um novo tubo cônico. Gire o líquido a 0,5 x g por 3 min e aspire o sobrenadante do pellet HPMC / RBC.
- Repita o processo três vezes: adicione 20 ml de PBS ao tecido picado, deixe o tecido crescer, remova o líquido do fundo com uma pipeta e no tubo HPMC / RBC, gire para baixo e remova o sobrenadante. Depois que todos os giros forem concluídos e o sobrenadante for aspirado, o pellet conterá HPMC e RBC.
- Coloque todas as células do pellet em um frasco de 75 cm2 em 15 ml de meio de crescimento completo (DMEM com 10% de soro fetal bovino [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de aminoácidos não essenciais MEM [81,4 mg / L], 1% de estreptomicina de penicilina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina e 100 μg / ml de estreptomicina]).
- Execute uma lavagem PBS secundária para isolar HPMCs adicionais.
- Para a lavagem secundária de PBS, agite o tecido sólido restante a 200 rpm, 37 ° C por 10 min em 20 ml de PBS e, em seguida, espere 1 min para que o tecido flutue até o topo. Remova o líquido do fundo do tubo para um novo tubo, centrifugue a 0,5 x g por 3 min e aspire o sobrenadante.
- Colocar em placas todas as HPMC/RBC da lavagem secundária com PBS num balão separado de 75 cm2 em 15 ml de meios de cultura completos.
- Para isolar qualquer HPMC restante, agite o tecido picado a 200 rpm, 37 ° C graus por 10 min em 20 ml de uma solução de tripsina 1: 1 0,25% tripsina 25 mM EDTA: PBS por volume. Deixe o tecido subir, colete o líquido no fundo do tubo em um novo tubo de 50 ml e gire para baixo a 0,5 x g por 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e colocar todo o HPMC/RBC num balão separado de 75 cm2 em 15 ml de meio de crescimento completo.
- Cultive as células plaqueadas a 37 ° C e 5% de CO2 em um ambiente umidificado. Alimente as células plaqueadas adicionando 15 ml de meio de crescimento completo nos dias 3 e 5 sem remover o meio gasto. HPMC pode ser cultivado por 5-7 dias antes de se dividir.
- Use HPMC de baixa passagem (até a passagem 2) em todos os experimentos para minimizar a desdiferenciação e modificação do fenótipo original. Use um microscópio de campo amplo de preferência com uma objetiva de 20x com recursos de contraste de interferência diferencial de plástico ou objetiva de 4-20x com recursos de contraste de fase (filtros de contraste de fase no microscópio) para tirar todas as imagens das células e uma objetiva de 10x () em campo claro para analisar a coloração imuno-histoquímica de 3,3'-Diaminobenzidina (DAB).
- Confirme se as HPMC são cuboidais e expressam citoqueratina 8 e vimentina realizando imuno-histoquímica (Figura 2A, C, E).
