Modelagem da colonização de células de câncer de ovário do omento: um método ex vivo para estabelecer a colonização por manchas leitosas de células de câncer de ovário marcadas com fluorescência em explantes de omento murino

Resumo

Fonte: Krishnan, V. et al. Abordagens in vivo e ex vivo para estudar a colonização metastática do câncer de ovário de estruturas de manchas leitosas no tecido adiposo peritoneal. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, estabelecemos uma cultura de órgãos omentais ex vivo sobreposta com células de câncer de ovário que expressam GFP para estudar a colonização do câncer de ovário dentro do explante omental. Este protocolo analisa estruturas de células imunes dentro do omento conhecidas como manchas leitosas que promovem metástases.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Colonização da Mancha Láctea Ex Vivo

1. Estabelecimento de condições básicas de cultura de órgãos omentais ex vivo
   1. Coloque cada omento em uma única placa de cultura e coloque dentro de um alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo 500 μl de meio DME/F12 contendo 20% de FCS. Manter as culturas de órgãos a 37 °C num ambiente de CO₂ a 5% durante 24 a 48 horas e/ou pontos de tempo adicionais. Use três omenta independentes (amostras triplicadas) para cada condição (por exemplo, tipo de mídia/ponto de tempo).
   2. Para confirmar a integridade dos tecidos nos parâmetros experimentais, fixar e processar as amostras conforme descrito na Etapa 1.1.3. A contagem de adipócitos saudáveis versus necróticos em seções de H&E pode avaliar a integridade do tecido. Um mínimo de ~ 120 células de cinco amostras biológicas é necessário para formular uma porcentagem de tecido vivo presente.
   3. Para medir a função do tecido, coloque omenta (n = 3) em poços separados de uma placa de 24 poços contendo 500 μl de meio DME / F12 com 20% de FCS. Deixar o omenta condicionar o meio a 37 °C num ambiente de CO₂ a 5% durante 24 horas e, em seguida, remover 250 μl para utilização num ensaio ELISA de IL-6.
2. Co-cultura ex vivo do omento de camundongo com células SKOV3ip.1-GFP
   1. Cultivar e preparar células marcadas com fluorescência pipetando 1x10⁶ células descongeladas em 10 ml de meio num balão T-75. Permitir que as células cresçam a 37 °C num ambiente de 5% de CO₂ até atingirem 70% de confluência. Tripsinizar e ressuspender a uma concentração de 2 x 10⁶ células por ml.
   2. Aplique ~ 6 μl do adesivo tecidual na membrana do inserto de cultura e deixe-o secar ao ar. Lave a membrana duas vezes com água estéril para remover qualquer adesivo excessivo. Seque as membranas ao ar sob uma capa laminar.
   3. Extirpar cuidadosamente o omenta e fixá-lo à membrana revestida com adesivo usando uma pinça estéril. Deixe o tecido aderir à membrana por 1 minuto antes de adicionar o meio. Adicionar 500 μl da suspensão celular sobre cada omento em cada inserção de cultura. Preencher a área em redor da câmara de tranhe com 2,5 ml de DME/F-12.
   4. Incubar omenta com suspensão celular por 6 horas a 37 ° C em um ambiente de 5% de CO₂. Remova e lave cuidadosamente a omenta com ~ 10 ml de PBS. Visualize focos de células cancerígenas fluorescentes usando um sistema de imagem fluorescente apropriado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ferramentas de dissecação	Ferramentas de Belas Ciências	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	Nº 48900
5% de formalina	sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Pbs	Corning	21-040-CV	Sem cálcio e magnésio
Colagenase	Worthington	LS004196
Inserto de placa de cultura de células milicelulares	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	Rolamento 354240