Obtenção de células primárias de câncer de ovário a partir de amostras sólidas: um método para cultivar células epiteliais de câncer de ovário a partir de amostras de tumor ovariano

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Processamento de Tissue

1. Trabalhando em condições estéreis, transferir as amostras para uma placa de Petri (60 mm x 60 mm) contendo 10 ml de PBS fresco e gelado e, utilizando uma lâmina de barbear estéril, cortada posteriormente nos pedaços mais pequenos possíveis (2 mm ou menos) (figuras 1A e 1B).
2. Transferir os tecidos picados para um tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de dispase II pré-aquecido (37 °C durante 30 min) (2,4 U/ml) em DMEM e incubar a 5% de CO₂ e 37 °C durante 30 min. Para garantir a digestão ideal das amostras, agite manualmente a pasta celular a cada 5 min.
3. Após 30 minutos de incubação, transferir (utilizando uma pipeta serológica de 10 ml) o chorume celular para um filtro de células (malha de 70 μm) colocado sobre um tubo cónico de 50 ml e aplicar uma ligeira pressão contra a malha utilizando um êmbolo de seringa. Rejeitar qualquer tecido não dissociado (que permaneça na parte superior da malha) e recolher a suspensão celular obtida no tubo cónico estéril de 50 ml. Centrifugar a 320 x g durante 7 min a 4 °C (figura 2).
4. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS.
5. Incubar a suspensão celular em uma placa de Petri a 5% de CO₂ e 37 °C (Figura 3).
6. Troque o meio após 24 horas do revestimento inicial. Isso permite a remoção de detritos celulares e da maioria dos eritrócitos presentes na cultura.
7. Troque o meio a cada três dias pelas duas semanas seguintes, após as quais as culturas de EOC primário estão prontas para aplicações a jusante.

Figura 1. Processamento de amostras clínicas. A) Espécime sólido transferido para uma placa de Petri contendo 10 ml de PBS 1x fresco e gelado. B) Espécimes clínicos cortados em pedaços de cerca de 2 mm de tamanho

Figura 2. Separação de células EOC de tecidos não dissociados. Após a digestão enzimática, as amostras clínicas são transferidas para um filtro de células e uma leve pressão é aplicada nas amostras clínicas digeridas usando um êmbolo de seringa. Isso permite o descolamento mecânico da EOC dos tecidos conjuntivos e a recuperação das células EOC

Figura 3. Plaqueamento da suspensão de células EOC resultante. Após a remoção de quaisquer tecidos não dissociados, a suspensão celular é centrifugada e ressuspensa em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS e incubada em uma placa de Petri a 5% de CO2 e 37 °C