Obtenção de células primárias de câncer de ovário a partir de amostras sólidas: um método para cultivar células epiteliais de câncer de ovário a partir de amostras de tumor ovariano

Resumo

Fonte: Pribyl, L. J. et al. Método para Obtenção de Células Primárias de Câncer de Ovário a partir de Amostras Sólidas. J. Vis. Exp. (2014)

Neste vídeo, descrevemos um método para isolar e caracterizar células primárias de câncer de ovário de amostras sólidas de tecido tumoral ovariano. As células epiteliais do câncer obtidas usando este protocolo são adequadas para entender os processos que podem levar à iniciação e desenvolvimento do câncer de ovário.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Processamento de Tissue

1. Trabalhando em condições estéreis, transferir as amostras para uma placa de Petri (60 mm x 60 mm) contendo 10 ml de PBS fresco e gelado e, utilizando uma lâmina de barbear estéril, cortada posteriormente nos pedaços mais pequenos possíveis (2 mm ou menos) (figuras 1A e 1B).
2. Transferir os tecidos picados para um tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de dispase II pré-aquecido (37 °C durante 30 min) (2,4 U/ml) em DMEM e incubar a 5% de CO₂ e 37 °C durante 30 min. Para garantir a digestão ideal das amostras, agite manualmente a pasta celular a cada 5 min.
3. Após 30 minutos de incubação, transferir (utilizando uma pipeta serológica de 10 ml) o chorume celular para um filtro de células (malha de 70 μm) colocado sobre um tubo cónico de 50 ml e aplicar uma ligeira pressão contra a malha utilizando um êmbolo de seringa. Rejeitar qualquer tecido não dissociado (que permaneça na parte superior da malha) e recolher a suspensão celular obtida no tubo cónico estéril de 50 ml. Centrifugar a 320 x g durante 7 min a 4 °C (figura 2).
4. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS.
5. Incubar a suspensão celular em uma placa de Petri a 5% de CO₂ e 37 °C (Figura 3).
6. Troque o meio após 24 horas do revestimento inicial. Isso permite a remoção de detritos celulares e da maioria dos eritrócitos presentes na cultura.
7. Troque o meio a cada três dias pelas duas semanas seguintes, após as quais as culturas de EOC primário estão prontas para aplicações a jusante.

Resultados

Figura 1. Processamento de amostras clínicas. A) Espécime sólido transferido para uma placa de Petri contendo 10 ml de PBS 1x fresco e gelado. B) Espécimes clínicos cortados em pedaços de cerca de 2 mm de tamanho

Figura 2.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x PBS, estéril	Invitrogen	14190-144
Tampa de rosca, amostra de polipropileno recipiente, estéril	Thermo Científico
Meio DMEM, estéril	Invitrogen	11995-065
Soro fetal bovino, estéril	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicilina-estreptomicina, líquida	Invitrogen	15140-122
Dispase II, estéril	Roche	Telefone: 04942 078 001
Pinça e bisturi de ponta fina pequena lâmina, estéril	Fisher Científico	fórceps: 08-953E, lâminas: 08-927-5D
Tesouras de dissecação pequenas, estéreis	Fisher Científico	Nº 08-945
Tubos cônicos de 15 ml, estéreis	Falcão BD	352097
Tubos cônicos de 50 ml, estéreis	Falcão BD	352027
Pipeta sorológica de 10 ml, estéril	Corning	13-678-11E
6 ml Êmbolo de seringa, estéril	Tyco Saúde	8881516911
Filtro de nylon (70 μm) filtro de células, estéril	Falcão BD	Rolamento 352350
Placa de Petri de 5 cm, estéril	Corning	430166
Placa de Petri de 10 cm, estéril	Corning	430167