1. Formação de Esferóides de Células de Câncer de Ovário
As - células de câncer de ovário que expressam RFP são cultivadas em meio de base 10% (um meio de cultura celular personalizado contendo uma mistura 50:50 de 199 e MCDB105, 10% de soro bovino fetal inativado e 1% de caneta estreptocócica). Para expressar RFP em células de câncer de ovário não marcadas, transfecte as células com um plasmídeo contendo RFP e selecione para células que expressam RFP. Alternativamente, vetores virais podem ser usados para expressar proteínas fluorescentes transitoriamente, ou as células podem ser pré-incubadas com um corante rastreador de células fluorescente vermelho (Invitrogen).
- Antes de formar esferóides de câncer de ovário, é necessário preparar placas de cultura de fundo redondo de 96 poços de baixa adesão. Para produzir placas de cultura de baixa adesão, adicione 30 μL de solução de poli-HEMA (6 mg de polihidroxietilmetacrilato em 1 ml de EtOH a 95%) a cada alvéolo de uma placa de cultura de células de 96 poços. As placas de 96 poços são incubadas em uma incubadora não umidificada a 37 °C para evaporar o etanol, deixando uma película de poli-HEMA em cada poço. Este filme poli-HEMA evita que as células se prendam ao fundo do poço, forçando as células a crescerem em suspensão. [Alternativamente, placas de cultura de fixação ultrabaixa (Corning) podem ser usadas.]
- Em seguida, tripsinize as células do câncer de ovário, coloque as células em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RCF por 3 minutos. Aspire o sobrenadante e ressuspenda em meio base a 10%.
- Conte as células usando um hemocitômetro.
- Ajuste a concentração de células de forma que haja 100 células por 50 μL de meio base a 10%.
- Adicione 50 μL da suspensão de células diluídas uniformemente suspensa a cada poço da placa de cultura revestida com poli-HEMA de 96 poços.
- Incube a placa de 96 poços em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C por 16 horas (esse período de tempo deve ser aumentado ou diminuído dependendo da quantidade de tempo que leva para uma determinada linha celular formar esferóides multicelulares ou condições experimentais desejadas) para permitir que as células do câncer de ovário se agrupem, formando um único esferóide multicelular em cada poço. Algumas células tumorais podem sofrer apoptose durante esse período, por isso é essencial escolher um momento antes da indução da apoptose.
2. Formação de Monocamada de Células Mesoteliais
- Em uma capa de cultura de células, pré-cubra os poços de uma placa MatTek com fundo de vidro de 6 poços com fibronectina, adicionando 2 mL de uma solução de fibronectina / mL PBS de 5 μg a cada poço da placa e incubando em temperatura ambiente por 30 minutos. A qualidade óptica dos fundos de vidro nas placas MatTek permite imagens microscópicas de alta resolução.
- As células mesoteliais que expressam GFP são cultivadas em meio de base a 10%. Tripsinize uma placa de células mesoteliais, gire em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RPM por 3 minutos, aspire o sobrenadante e ressuspenda em meio de base a 10%. As células mesoteliais usadas aqui já expressavam GFP quando foram obtidas, mas as células mesoteliais não marcadas podem ser produzidas por transfecção com um plasmídeo contendo cDNA GFP ou pré-incubação das células em um corante rastreador de células fluorescente verde (Invitrogen).
- Após a incubação de fibronectina de 30 minutos (na etapa 2.1), lave os poços da placa MatTek com 2 mL de PBS.
- Aspire o PBS e coloque 6 x105 células mesoteliais por poço em cada poço da placa MatTek de 6 poços. Incube a placa MatTek em uma incubadora de cultura de células a 37 °C durante a noite para permitir que as células mesoteliais se fixem à placa e formem uma monocamada.
3. Ensaio de Depuração de Células Mesoteliais
- Use uma pipeta para coletar os esferoides do câncer de ovário da placa revestida com poli-HEMA de 96 poços.
- Aspire o meio de um poço da placa MatTek de 6 poços contendo uma monocamada de células mesoteliais. Lave uma vez com 2 mL de PBS. Adicione todos os esferóides da placa de 96 poços a um poço da antena MatTek (~ 3x o número de esferoides que serão fotografados para contabilizar os esferoides que pousam na parte da antena que não pode ser visualizada).
- Coloque a placa MatTek no stage de um microscópio de fluorescência de campo amplo invertido capaz de realizar imagens de lapso de tempo por pelo menos 8 horas. Use um estágio motorizado para criar imagens de várias posições no prato, com vários eventos de intercalação esferoide, em um único experimento. Usamos um microscópio de lapso de tempo de fluorescência de campo amplo motorizado invertido Nikon Ti-E com sistema de foco perfeito integrado e óptica de baixa ampliação [20x-0,75 abertura numérica (NA)]/contraste de interferência diferencial (DIC) NA, um transiluminador de halogênio Nikon com condensador de longa distância de trabalho (LWD) de 0,52 NA, filtros de excitação e emissão rápidos (tempo de comutação de <100 milissegundos) da Nikon (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), obturadores inteligentes de transmissão rápida e de caminho de luz de epifluorescência Sutter, um estágio motorizado codificado linear da Nikon, uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) refrigerada Hamamatsu ORCA-AG, uma câmara de incubação de microscópio personalizada com controle de temperatura e CO2, software Nikon NIS-Elements AR versão 3 e uma mesa de isolamento de vibração TMC.
- Os esferóides das células cancerígenas do ovário se depositam no fundo do prato e se ligam à monocamada das células mesoteliais. Colete GFP, RFP e imagens de fase de 20+ interações esferóides/monocamada a cada 10 minutos, por 8 horas.
- Os esferóides de células de câncer de ovário que expressam RFP invadirão a monocamada de células mesoteliais que expressam GFP, criando um buraco na monocamada. Após 8 horas, meça os tamanhos dos buracos traçando os buracos negros nas imagens GFP usando o software Elements (ou outro software adequado, como a imagem J). Normalize o tamanho do furo para o tamanho inicial do esferoide, dividindo o tamanho do furo em 8 horas pelo tamanho do esferoide na imagem RFP correspondente no tempo zero. Neste exemplo, o tamanho do furo foi medido apenas uma vez, mas pode ser medido várias vezes ao longo do experimento de oito horas para entender melhor a dinâmica da intercalação.
