Determinando a frequência de campo de tratamento inibitório ideal de tumores para células cancerígenas: um método in vitro não invasivo para avaliar o efeito dos TTFields na viabilidade das células cancerígenas

Resumo

Fonte: Porat, Y. et al. Determinando a frequência inibitória ideal para células cancerígenas usando campos de tratamento de tumor (TTFields). J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o efeito da aplicação do TTField no crescimento de linhagens celulares de câncer de ovário in vitro. Este ensaio pode ajudar a determinar a frequência ideal do campo elétrico que pode levar a uma redução máxima no número de células cancerígenas.

Protocolo

1. Sistema de Aplicação In Vitro TTFields - Manutenção da Placa de Base e do Prato

1. Lave a louça e as tampas dos pratos em água corrente da torneira. Em seguida, enxágue com água deionizada e seque ao ar com a face voltada para baixo.
2. Se um agente quimioterápico / medicamento foi adicionado aos pratos em um experimento anterior, encha cada prato com uma solução de detergente leve a 5% e deixe durante a noite.
   1. Lave bem a louça em água corrente da torneira para evitar vestígios de detergente dentro da louça. Lave a louça e as tampas com água deionizada e seque ao ar com a face voltada para baixo.
3. Insira os pratos limpos e secos com suas tampas em sacos de esterilização. Feche e coloque os sacos em autoclave, com a louça voltada para baixo. Autoclave por 30 min a não mais de 121 °C.
4. Coloque a autoclave em um programa seco, abra parcialmente a porta da autoclave e seque a louça por 30 min.
5. Limpe a placa de base com um pano levemente umedecido com etanol a 70%.

2. Configuração do experimento

NOTA: Todos os equipamentos e materiais utilizados neste protocolo estão descritos na Lista de Materiais. Todas as etapas abaixo devem ser executadas dentro de um gabinete de fluxo laminar enquanto as condições estéreis são mantidas.

1. Prepare pratos e tampas TTFields limpos e estéreis, conforme descrito na seção 1. Limpe a placa de base com um pano levemente umedecido com etanol a 70%.
2. Instale as placas TTFields com as tampas na placa de base pressionando suavemente a placa e girando no sentido horário cerca de 5 mm até que a borda da placa trave nos três pinos da placa de base. Coloque uma lamínula estéril de 22 mm (plástico ou vidro tratado) no fundo de cada prato.
3. Preparar a suspensão celular em meio de crescimento completo (meio de Eagle modificado de Dulbecco para U-87 MG e F98; RPMI para A2780 e OVCAR-3; complementado conforme descrito na Lista de Materiais).
   NOTA: As concentrações celulares dependem dos tipos de células e da duração do experimento; O crescimento de células confluentes de 80% a 90% não deve ser excedido até o final do experimento.
   CUIDADO: As linhagens de células humanas podem representar um risco biológico e devem ser manuseadas com as medidas de segurança apropriadas.
4. Coloque 200 μL de suspensão celular (geralmente 5.000-20.000 células em 200 μL para um experimento de 72 horas, dependendo do tempo de duplicação) como uma gota no centro de cada lamínula e cubra com as tampas dos pratos.
5. Incubar a 37 °C numa incubadora de CO₂ até as células aderirem; é possível uma incubação durante a noite nesta fase.
6. Aspire os fluidos da gota usando uma pipeta de 200 ou 1.000 μL.
7. Pipete suavemente 2 mL de meio de crescimento completo para encher cada prato. Use uma ponta estéril para pipetar e bata suavemente nas bordas da lamínula para liberar as bolhas de ar ocasionalmente presas sob a lâmina.
8. Cubra os pratos com suas tampas e coloque-os dentro de uma incubadora de CO₂ a 37 °C até o início do tratamento com TTFields.

3. Aplicativo TTFields

1. Transfira as placas de base com as placas TTFields anexadas para uma incubadora refrigerada de CO₂.
   NOTA: A aplicação in vitro de TTFields gerará calor; portanto, é necessária uma incubadora refrigerada para compensar o aquecimento dos pratos. Intensidades mais altas de TTFields produzirão mais calor e exigirão temperaturas ambientes mais baixas da incubadora (ver Tabela 1). As intensidades de TTFields clinicamente relevantes são alcançadas quando a temperatura da incubadora para aplicação de TTFields está na faixa de 18-30 °C.
2. Conecte o conector fêmea do cabo plano à placa de base. Ligue o gerador TTFields.
3. Inicie o software do sistema de aplicação in vitro TTFields e selecione as configurações do experimento.
   1. Defina um novo experimento. Digite o nome do experimento e o proprietário do experimento na interface do usuário do software na tela do computador. Ajuste a frequência e a temperatura alvo para cada prato ou placa de base.
4. Inicie o aplicativo TTFields usando o software.
5. Verifique se todos os pratos estão conectados corretamente e aparecem em azul claro no monitor. Se um prato estiver circulado com uma moldura vermelha (o que significa que não está conectado corretamente), pressione-o suavemente e gire lentamente para frente e para trás até que os contatos sejam restaurados e o prato apareça em azul claro.
6. Deixe o sistema de aplicação in vitro TTFields funcionando por até 24 horas.
7. Se o experimento atingir seu ponto final, interrompa-o clicando no botão END EXPERIMENT no software e prossiga para a etapa 5. Caso contrário, clique em PAUSAR experimento.
8. Desconecte o conector do cabo plano da placa de base. Remova a placa de base com os pratos da incubadora para um gabinete de fluxo laminar.
9. Substitua o meio em todos os pratos a cada 24 h e retorne a placa de base para a incubadora refrigerada. Conecte a placa de base ao gerador usando o cabo plano. Continue o experimento clicando no botão CONTINUAR.

Temperatura ambiente da incubadora	Intensidades esperadas de TTFields
(°C)	(V/cm RMS)
18	1,62
19	1,55
20	1,48
21	1.41
22	1,33
23	1.26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0,97
28	0,9
29	0,83
30	0,76

Tabela 1. Temperatura ambiente da incubadora e intensidades esperadas de TTFields dentro da placa TTFields.

4. Amostras de controle

Nota: Cultive células de controle em condições semelhantes às células tratadas com TTFields, excluindo a aplicação de TTFields.

1. Amostras de controle de placas com a mesma suspensão e em uma superfície semelhante usada para plaquear amostras tratadas com TTFields.
2. Colocar as placas de controlo numa incubadora de CO₂ a 37 °C.
3. Substitua o meio na loiça a cada 24 h para corresponder às condições do meio da loiça tratada com TTFields.

5. Fim do experimento

1. Depois de clicar em END EXPERIMENT, aguarde até que o software recupere todos os registros do sistema e salve os registros no computador.
2. Use o botão RELATÓRIOS para revisar os arquivos de registro de temperatura, corrente e resistência de cada placa de base para verificar se todos os pratos foram tratados de acordo com o plano experimental.
   NOTA: Todos os relatórios e logs são salvos no computador após o término do experimento e podem ser revisados a qualquer momento.
3. Desligue o gerador TTFields.
4. Desconecte o cabo plano da placa de base e remova-o da incubadora.
5. Para remover um prato de cerâmica, pressione e gire o prato no sentido anti-horário para destravá-lo da placa de base.
6. Leve a louça para um gabinete de fluxo laminar e remova assepticamente as lamínulas. Transfira-os para placas de Petri estéreis contendo meio fresco ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) para inspeção e avaliação posteriores.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema e software Invitro	Novocure	ITG1000 e IBP1000	Cada unidade contém 1 gerador TTFields, 1 placa de base, 8 pratos TTFields com tampas e 1 cabo plano.
Sacos de esterilização	Westfield medica	Rolamento 24882
Slides de cobertura de plástico	Thermo Scientific (NUNC)	174977	Pré tratado e esterilizado
Corrediças de cobertura de vidro	Thermo Scientific (Menzel-Gläser)	CB00220RA1	Esterilize se necessário
Meio de águia modificado de Dulbecco	Indústrias Biológicas (Israel)	01-055-1A	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar
RPMI 1640	Gibco	Rolamento 21875-034	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar
Soro fetal bovino (FBS)	Indústrias Biológicas (Israel)	04-007-1A	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar
L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco	Rolamento 25030-029
Caneta/estreptococos (penicilina 10.000 U/mL, estreptomicina 10.000 μg/mL)	Gibco	15140-122
Solução de piruvato de sódio 100 mM	Indústrias Biológicas (Israel)	03-042-1B
Tampão Hepes 1 M	Indústrias Biológicas (Israel)	03-025-1B
Solução de insulina de pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0,25% de tripsina / EDTA	Indústrias Biológicas (Israel)	03-050-1B	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar
metanol	Merck	1.06009.2511	Arrefecer a -20 °C no congelador antes de utilizar
Pbs	Indústrias Biológicas (Israel)	02-023-1A	Sem cálcio e magnésio
A2780	ECACC	93112519	Crescer em RPMI 1640 suplementado com FBS (10%), caneta/estreptococo (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sódio (1 mM) e tampão Hepes (12 mM).
F98	ATCC	CRL-2397	Crescer em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com FBS (10%), caneta/estreptococos (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sódio (1 mM) e glutamina (2 mM).
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	Crescer em RPMI 1640 suplementado com FBS (20%), caneta/estreptococos (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sódio (1 mM), tampão Hepes (12 mM) e insulina (10 μg/mL).
U-87 MG	ATCC	HTB-14	Crescer em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com FBS (10%), caneta/estreptococos (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sódio (1 mM) e glutamina (2 mM).
incubadora de CO2 refrigiada	caron	7404-10-3
Armário de fluxo laminar	ADS Laminair	Bio12 e VSM12