$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo embriões de ovos de galinha foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Preparando os ovos
- Antes de receber os ovos, monte e equilibre a incubadora de ovos a 37,8 °C (100 °F) com 60-70% de umidade seguindo as instruções do fabricante.
nota: Para minimizar os riscos de contaminação, água autoclavada pode ser usada para controlar a umidade.
- Ao receber ovos de galinha Rhode Island Red fertilizados de um fornecedor de ovos certificado de laboratório, limpe a superfície das cascas com toalhas de papel. Uma toalha de papel levemente umedecida pode ser usada para remover o material aderido. Seque imediatamente.
nota: Molhar a casca com líquido abaixo de 43,3 °C pode introduzir bactérias no ovo. Se alguém optar por lavar ou desinfetar os ovos, a temperatura do líquido deve estar entre 43,3-48,9 °C. Temperaturas mais altas podem ferver os ovos. A escolha do desinfetante deve ser feita com base nos microrganismos que causam preocupação.
- Use um lápis ou marcador para rotular a data no ovo. Este é considerado o dia de desenvolvimento 0.
- Coloque os ovos na incubadora de ovos e incube por pelo menos 7 dias com rotação para permitir o desenvolvimento do CAM. Um rotador automático pode ser usado, ou os ovos podem ser girados 180 ° 2-3x por dia.
2. Abrindo os ovos
NOTA: A abertura dos ovos deve ser feita quando o CAM estiver totalmente desenvolvido. Normalmente, isso ocorre no dia 7 ou 8 de desenvolvimento.
- Desinfete um gabinete de biossegurança com etanol 70%. Da mesma forma, desinfete e coloque no armário de biossegurança um suporte para ovos, veleiro para ovos, marcador, ferramenta rotativa sem fio com pedra de esmeril de carboneto de silício e disco de corte circular, agulha de 18 G, controlador de pipeta com tubo de vácuo de um quarto de polegada, fita adesiva, tesoura de escritório, tesoura curva, pinça Semken (ou similar), bolas de algodão e curativo de filme transparente de 6 x 7 cm. Sempre que possível, use ferramentas estéreis, descartáveis ou autoclavadas.
- Desligue o rotador de ovos. Coloque aproximadamente 1-3 ovos no armário de biossegurança na prateleira de ovos. Enquanto estiver no escuro, coloque o candler contra a casca do ovo para identificar a célula de ar. Marque a localização da célula de ar.
nota: A intensidade da iluminação do candler do ovo é crucial para visualizar o interior do ovo. Se a célula de ar ou vasculatura for consistentemente difícil de ver, tente substituir as baterias do veleiro de ovo.
- Mova o candler de ovo sobre a casca para encontrar uma grande rede de vasos sanguíneos. Gire o ovo, se necessário. Uma vasculatura ideal será ramificada perto do meio do ovo. Use um marcador para desenhar sobre a vasculatura a ser usada para implantação.
- Acenda a luz no capô. Usando uma ferramenta rotativa sem fio equipada com uma pedra de esmeril de carboneto de silício, faça um pequeno orifício na concha diretamente sobre o centro da célula de ar. Perfure até que a maior parte da casca tenha sido removida, mas a membrana interna branca esteja intacta.
nota: A perfuração sobre a câmara de ar antes de atingir a vasculatura permite determinar a espessura dessa casca de ovo específica sobre a célula de ar, em vez de sobre o CAM e a vasculatura. Se o CAM ou a vasculatura forem interrompidos, o óvulo não poderá ser usado para implantação.
- Faça um pequeno orifício onde a janela vascular será aberta como foi feito para a câmara de ar (passo 2.4).
- Usando uma agulha de 18 G, perfure suavemente a membrana interna branca sobre a câmara de ar e a vasculatura. Se não conseguir penetrar na casca, perfure um pouco mais com cuidado. Certifique-se de que a membrana interna branca (mas não o CAM) seja rompida em toda a área perfurada. A remoção da peça da membrana não é necessária.
nota: Se o CAM ou vasculatura for interrompido durante esta etapa, descarte o ovo. O dano é evidente se houver sangue ou albumina vazando de um orifício perfurado.
- Desligue a luz do capô. Usando o candler de ovo, verifique se a célula de ar foi transferida da extremidade do ovo para a área sobre a vasculatura. Se necessário, coloque o tubo de vácuo inserido em um controlador de pipeta ao redor do orifício sobre a câmara de ar original e aplique suavemente a sucção em rajadas curtas para mover a câmara de ar.
- Use um marcador para delinear a nova localização da célula de ar aproximadamente 0,5 cm dentro do limite ar-CAM. Fixe um pedaço de fita adesiva logo acima da nova célula de ar. Se necessário, use uma tesoura de escritório padrão para aparar a fita em um tamanho apropriado.
nota: A fita pode interromper o fluxo de ar através do invólucro e não deve ser maior do que o necessário para cobrir totalmente a célula de ar.
- Retorne os ovos para a incubadora para aquecer sem rotação com a nova célula de ar voltada para cima. Repita as etapas 2.2-2.9 para que os ovos restantes sejam abertos.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Se não tiver certeza da qualidade do desenvolvimento do CAM, um pequeno número de ovos deve prosseguir com a etapa 2.16 antes de abrir os ovos restantes.
- Coloque aproximadamente 1-3 ovos com células de ar realocadas na prateleira de ovos no gabinete de biossegurança.
nota: Deve-se tomar cuidado para evitar a introdução de contaminação no ovo aberto. Portanto, sempre abra os ovos dentro de um armário de biossegurança e use ferramentas e equipamentos estéreis sempre que possível.
- Usando uma ferramenta rotativa sem fio equipada com um disco de corte circular, corte uma pequena linha sobre o limite da célula de ar desenhada na etapa 2.8. Certifique-se de que esteja aproximadamente 0.5 cm dentro do limite real do ar-CAM para evitar interromper o CAM ou a vasculatura. Corte completamente a casca, mas tome cuidado para não penetrar profundamente o suficiente para romper o CAM ou a vasculatura.
- Usando uma tesoura curva, corte ao redor da célula de ar restante para criar uma janela na casca.
nota: Se houver sangue ou membrana na casca removida, o óvulo não é adequado para implantação. Se uma alta proporção dos ovos não for aberta de forma limpa, considere esperar pelo menos mais 1 dia para abrir os ovos restantes para permitir uma melhor formação de CAM. Se as cascas dos ovos restantes não tiverem sido perfuradas, a rotação dos ovos dentro da incubadora deve ser retomada.
- Verifique a viabilidade do embrião. Os embriões viáveis exibirão vasculatura extensa, albumina clara, movimento do embrião ou batimentos cardíacos visíveis.
- Usando uma pinça Semken, puxe pequenos pedaços de algodão de uma bola de algodão estéril. Seque suavemente a superfície CAM para remover a poeira e os detritos do invólucro.
nota: A remoção de detritos deve ser realizada no mesmo dia em que os ovos são abertos.
- Cubra a abertura do invólucro com um quarto de um quarto de curativo de filme transparente de 6 x 7 cm.
- Devolva os ovos à incubadora. Certifique-se de que o ovo fique bem encaixado com a janela aberta voltada para cima e o CAM não tocando no curativo de filme transparente. Use um pedaço de prateleira de ovos, a borda do rotador de ovos ou outro item adequado para sustentar os ovos que continuam rolando.
- Repita as etapas 2.10-2.16 para que todos os ovos restantes sejam abertos.
nota: A abertura dos óvulos não precisa ser concluída no mesmo dia da implantação. Esperar pelo menos 1 dia pode ajudar a eliminar os ovos cuja viabilidade foi comprometida pela abertura da casca.