Modelagem de câncer baseada em membrana corioalantóide de frango: um modelo in ovo para estudar tumorigênese e metástase de células cancerígenas

Resumo

Fonte: Sharrow, A. C. et al. Usando o modelo in vivo de membrana corioalantóide de frango para estudar cânceres ginecológicos e urológicos. J. Vis. Exp.(2020)

Neste vídeo, descrevemos a implantação de células cancerígenas em uma membrana corioalantóide de galinha para gerar um modelo in ovo. O modelo enxerta com sucesso as células do câncer de ovário para estudar a progressão do câncer ginecológico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparando a suspensão de células cancerígenas para transplante (opção 1)

NOTA: Isso deve ser concluído imediatamente antes do implante, que idealmente deve ocorrer entre os dias 7 e 10. Consulte as notas no início da etapa 3 ou 4 para obter mais informações sobre a data de implantação. Essa abordagem foi usada para todas as linhagens celulares e digestão de tumores de câncer renal cultivados.

1. Descongele a solução de matriz extracelular no gelo.
2. Obtenha-se, através de uma digestão mecânica e/ou enzimática, uma suspensão unicelular utilizando um método adequado ao tipo de célula a implantar.
3. Ressuspenda o número total de células a serem implantadas em um meio apropriado para implantação. Implantes de 1-2 x 10⁶ células por óvulo são típicos.
   nota: O meio usado para a implantação das linhagens celulares é normalmente o meio completo usado para cultivar as células, contendo FBS ou reposição de soro. A implantação de digestões tumorais normalmente usa o meio completo usado para cultivar linhagens celulares do mesmo tipo de câncer. No entanto, ajustes na formulação do meio podem ser feitos se necessário experimentalmente. Os efeitos no desenvolvimento e crescimento do tumor precisariam ser determinados empiricamente.
4. Pulverize as células usando uma velocidade de centrífuga e tempo apropriados para as células que estão sendo usadas. As velocidades típicas são 250-300 x g e os tempos são de 5 a 10 min.
5. Remover o sobrenadante das células peletizadas pipetando. Ressuspenda mecanicamente as células no meio residual por meio de movimentos ou pipetagem. Coloque no gelo para esfriar. Meça o volume das células e do meio usando uma pipeta de tamanho apropriado.
6. Calcule os volumes de implantação de forma que 1-2 x 10⁶ células sejam implantadas em um volume de 20-100 μL por óvulo com uma concentração final de matriz extracelular de 2,7-4 mg / mL de proteína. Adicione o meio, quaisquer fatores de crescimento ou aditivos desejados e a solução de matriz extracelular de acordo com este cálculo. Mantenha no gelo até que esteja pronto para implantar.
   nota: Para os cálculos das etapas 1.3 e 1.6, um volume extra de pelo menos meio implante de óvulo deve ser incorporado para garantir um volume adequado para todos os óvulos do grupo. Para a implantação das linhagens celulares de câncer de ovário (ou seja, SKOV3 e ID8), foram implantadas 10⁶ células por óvulo. Para implantação da linha celular de carcinoma de células renais RENCA, células cultivadas derivadas de carcinoma de células renais humano primário digerido, linhagens celulares de câncer de próstata (ou seja, CWR, C4-2 e MyC-CaP) e linhagens celulares de câncer de bexiga (ou seja, HT-1376 e T24), 2 x 10⁶ células foram implantadas.

2. Preparando pedaços de tumor para implantação (opção 2)

NOTA: Isso deve ser concluído imediatamente antes da implantação, que idealmente deve ocorrer entre os dias 7 e 10. Consulte as notas no início da etapa 3 ou 4 para obter mais informações sobre a data de implantação. Os cânceres primários de ovário e bexiga foram implantados como pedaços de tumor.

1. Descongele a solução de matriz extracelular no gelo. Diluir até uma concentração final de proteína de 2,7-4 mg/ml num meio apropriado que contenha quaisquer fatores de crescimento ou aditivos desejados. Mantenha o ice.
   nota: A implantação de pedaços de tumor normalmente usa o meio completo usado para cultivar linhagens celulares do mesmo tipo de câncer. No entanto, ajustes na formulação do meio podem ser feitos se necessário experimentalmente. Os efeitos no enxerto e crescimento do tumor precisariam ser determinados empiricamente.
2. Usando um bisturi ou tesoura, retire pedaços do tumor fresco. Os tamanhos ideais variam de 2 a 5 mm de cada lado. Mantenha os tecidos imersos no meio até que estejam prontos para implantar.

3. Implantação com anel antiaderente (opção 1)

NOTA: As células podem ser implantadas a partir do dia 7 de desenvolvimento se o CAM estiver totalmente desenvolvido. A implantação pode ocorrer a qualquer momento antes da eclosão, o que permite tempo adequado para o desenvolvimento do tumor e o experimento desejado, mas observe que as células imunes do embrião começam a estar presentes por volta do dia 10 após a fertilização. A taxa de crescimento do tumor varia consideravelmente de acordo com o tipo de célula e precisa ser determinada empiricamente para o tipo de célula de interesse. O câncer de ovário e as células de câncer de próstata foram implantados usando o método do anel antiaderente. Observe que, quando um anel antiaderente não estiver disponível, uma ponta de pipeta pode ser cortada em um tamanho semelhante e usada.

1. Use etanol 70% para desinfetar um armário de biossegurança e todas as ferramentas necessárias: um suporte para ovos, pinça de íris curva, anéis antiaderentes (diâmetro interno de 1/4 de polegada), haste de agitação de vidro, pipetas e pontas de volume apropriado, curativo de filme transparente de 6 x 7 cm, tesoura de escritório e marcador ou lápis. Sempre que possível, devem ser utilizadas ferramentas estéreis, descartáveis ou autoclavadas.
2. Coloque os ovos a serem implantados em uma prateleira de ovos em um armário de biossegurança. Selecione um número gerenciável de ovos. Até seis é típico. Evite permitir que os ovos esfriem substancialmente enquanto trabalha com eles.
3. Remova o curativo de filme transparente da concha rolando as bordas em direção à janela aberta para evitar arrancar pedaços de concha. Verifique se os ovos são viáveis e saudáveis. Os ovos ideais terão um grande vaso no centro da área aberta com vasos menores ramificando-se a partir dele.
4. Usando uma pinça de íris curva, coloque um anel estéril e antiaderente no CAM sobre o vaso, de preferência sobre um ponto de ramificação. Use uma haste de agitação de vidro estéril para lixar suavemente o CAM.
5. Pipetar a suspensão da célula da etapa 1.6 para o centro do anel antiaderente. Alternativamente, use uma pinça para colocar um pedaço de tumor da etapa 2.2 no centro do anel antiaderente e cubra com 20-50 μL da solução de matriz extracelular gerada na etapa 2.1.
6. Sele a abertura com um quarto de curativo de filme transparente de 6 x 7 cm. Rotule os ovos com uma designação de implante apropriada.
   nota: Numerar os ovos dentro de um grupo facilita as observações longitudinais.
7. Devolva o ovo à incubadora. Certifique-se de que a abertura da casca esteja ereta e que o ovo esteja seguro.
   nota: Os ovos podem ser devolvidos a uma incubadora de ovos sem rotação. Alternativamente, alta viabilidade pós-implante pode ser obtida usando uma incubadora de células de 37-38 °C com o CO₂ desativado e um higrômetro para monitorar a umidade, que deve ser de 50% a 80%.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
010 Teflon (PTFE) Branco 55 Duro Shore D O-Rings	A loja O-Ring	TEF010	Anel antiaderente para semeadura celular. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Politetrafluoretileno (PTFE).
Tesoura de operação delicada; Curvo; Afiado-afiado; Comprimento da lâmina de 30 mm; 4-3/4 pol. Comprimento total	Roboz Cirúrgico	RS6703	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer tesoura curva semelhante também funcionaria.
Kit de ferramentas Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max	Dremel	8050-N/18	Este kit contém todas as ferramentas necessárias
Ovos de galinha fertilizados (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	Um fornecedor local de ovos precisaria ser identificado, pois esse fornecedor só entrega regionalmente.
Hovabator Genesis 1588 Kit Combo de Incubadora de Ovos Deluxe	Armazém da Incubadora	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Outras incubadoras de ovos podem ser usadas, mas sua confiabilidade precisaria ser verificada. Após a implantação, uma incubadora de células com o CO2 desativado também pode ser usada.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Armazém da Incubadora	1102	Outros candlers podem ser usados; no entanto, este é preferido entre aqueles que testamos. Este candler está incluído no kit de incubadora mencionado acima.
Matriz de Membrana Matrigel HC; Sem LDEV	Corning	354248	Solução de matriz extracelular
SKOV3	ATCC	HTB-77	Linha celular de câncer de ovário humano.
Agitando as hastes com o policial de borracha; diâmetro de 5mm, comprimento de 6 pol.	Suprimentos Científicos Unidos	GRPL06	Isso é fornecido como um exemplo. Qualquer haste de agitação de vidro semelhante também funcionaria.
Pinça de amostra	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 72914	Isso é fornecido como um exemplo. A pinça usada para afastar a concha para imagens de bioluminescência tem aproximadamente 12,8 cm de comprimento com pontas de 3 mm de largura.