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1. Tratamento com bissulfito
- Use 45 μL da solução de tecido digerido como amostra.
- Realize o tratamento com bissulfito usando reagentes em um kit de conversão de bissulfito de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Adicionar 5 μl de tampão de diluição à amostra de ADN e incubar a 37 °C durante 15 min (ver quadro de materiais).
- Enquanto as amostras estão incubando, prepare o reagente de conversão de bissulfito adicionando 750 μL de dH2O e 210 μL de tampão de diluição a um tubo de reagente de conversão CT (consulte a Tabela de Materiais). Misture os tubos por vórtice por 10 min.
- Após a incubação de 15 minutos, adicione 100 μL do reagente de conversão CT preparado a cada amostra e misture por inversão.
- Incubar as amostras no escuro a 50 °C durante 12 a 16 h.
- Após a incubação, retire as amostras e coloque-as no gelo por 10 min.
- Adicione 400 μL de tampão de ligação e misture cada amostra pipetando para cima e para baixo (consulte a Tabela de Materiais). Carregue cada amostra em uma coluna de centrifugação e coloque a coluna em um tubo de coleta de 2 mL (consulte a Tabela de Materiais).
- Centrifugue cada amostra em velocidade máxima (10.000 x g) por 1 min e descarte o fluxo.
- Adicione 200 μL de tampão de lavagem a cada coluna e gire em velocidade máxima por 1 min, descartando o fluxo (consulte a Tabela de Materiais).
- Adicione 200 μL de tampão de dessulfonação a cada coluna e deixe a coluna permanecer em temperatura ambiente por 15 min (consulte a Tabela de Materiais). Após a incubação, gire as colunas em velocidade máxima por 1 min e descarte o fluxo.
- Adicione 200 μL de tampão de lavagem a cada coluna e gire em velocidade máxima por 1 min (consulte a Tabela de Materiais).
- Repita esta etapa mais uma vez.
- Adicione 46 μL de dH2O a cada coluna e coloque cada coluna em um novo tubo estéril de polipropileno descartável de 1,5 mL (consulte a Tabela de Materiais). Gire cada tubo por 2 min para eluir o DNA.
- Remova cada coluna de centrifugação do tubo de polipropileno descartável e descarte (consulte a Tabela de Materiais). O DNA agora está pronto para a análise.
2. PCR Quantitativa Específica de Metilação (qMSP)
- Use o DNA modificado com bissulfito da etapa 1.3 como modelo para PCR em tempo real baseado em fluorescência em qMSP para avaliar a metilação da região promotora em cada análise gênica.
- Execute o qMSP usando um instrumento de PCR em tempo real de 96 poços (consulte a Tabela de Materiais).
- Verifique o status de metilação do promotor do gene alvo no DNA modificado com bissulfito usando primer direto de 200 nM, primer reverso de 200 nM e sondas de 80 nM. Prepare a mistura principal com 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10 nM de fluoresceína, 0,166 mM de cada trifosfato de desoxinucleotídeo e 0,04 U/μl de DNA polimerase (ver Tabela de Materiais). O volume final de reação em cada poço para todos os ensaios é de 25 μL.
- Execute o ciclo de qMSP da seguinte forma: 95 °C por 5 minutos, seguido por 55 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min e 72 °C por 1 min.
NOTA: O gene alvo deve ser escolhido com base nos critérios de ter valores beta maiores, estar relacionado às ilhas CpG na região promotora e ser adequado para o projeto de primer e sonda para qMSP.
- Use a genômica humana tratada com CpG Metilase (M.SssI) como controle positivo de metilação (ver Tabela de Materiais).
nota: A quantificação final da metilação é definida como o valor relativo de metilação (RMV) e calculada como 2–ΔΔCt para cada réplica de detecção de metilação em comparação com o Ct médio para β-actina (ACTB). As sequências de primer e sonda são mostradas na Tabela 1. Um Ct de 100 é usado para réplicas não detectadas, o que dá um valor de 2–ΔΔCt próximo de zero. A seguinte fórmula é usada:
média 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.
| gene | Frente 5' - 3' | Reverso 5' - 3' | sondar |
| B-ACTINA | TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |