$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Criopreservação de tecidos
NOTA: Esta parte faz referência principalmente aos métodos do Kit Criogênico do Kit de Tecidos Vivos. Os principais kits e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.
- Eutanasiar os camundongos com um método aprovado pelo IRB quando o tumor tiver mais de 10 mm de diâmetro.
- Usando fórceps e tesouras estéreis, isole lentamente o tumor dos camundongos.
- Lave os tecidos tumorais com DPBS em um prato de 10 cm. Disseque e remova áreas necróticas, tecido adiposo, coágulos sanguíneos e tecido conjuntivo com fórceps e tesoura.
- Corte os tecidos tumorais com um máximo de 1 mm de espessura com um molde.
- Lave as fatias com DPBS em um prato de 10 cm.
nota: O processo de vitrificação envolve o uso de tubos rotulados como V1/V2/V3 nas etapas 1.6-1.8. Os ingredientes principais são DMSO e sacarose.
- Transferir as fatias para o tubo V1 com uma pinça e incubar o tubo a 4 °C durante 4 min. Enrolar e inverter brevemente o tubo e colocá-lo a 4 °C durante mais 4 min.
- Despeje a solução V1 e as fatias em um prato de 10 cm. Transfira as fatias para o tubo V2 com uma pinça e incube o tubo V2 a 4 °C por 4 min. Enrolar e inverter brevemente o tubo e colocá-lo a 4 °C durante mais 4 min.
- Despeje a solução V2 e as fatias em um prato de 10 cm. Transfira as fatias para o tubo V3 com uma pinça e incube o tubo a 4 °C por 5 min. Enrole e inverta o tubo brevemente e coloque-o a 4 °C por pelo menos 5 min. Certifique-se de que todas as fatias afundem no fundo do tubo.
- Se várias fatias permanecerem flutuando, enrole e inverta o tubo brevemente e coloque o tubo a 4 ° C novamente até que todas as fatias afundem completamente; se necessário, descarte as fatias flutuantes.
- Despeje a solução V3 e as fatias em um prato de 10 cm.
- Corte os porta-lenços no comprimento adequado e coloque-os em gaze estéril. Transfira as fatias para os suportes. Enrole os suportes com a gaze e coloque-os em nitrogênio líquido usando uma pinça, seguido de incubação por 5 min.
- Rotule os frascos criogênicos com as informações do tecido.
- Transfira os suportes com fatias de tecido para frascos criogênicos, que são armazenados em nitrogênio líquido.