Isolamento de neutrófilos de baixa densidade peritoneal: uma técnica para obter neutrófilos de baixa densidade a partir de fluido de lavagem peritoneal usando classificação de células ativadas por magnetismo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Isolamento de LDN de Lavagens da Cavidade Abdominal

1. Aquisição de amostras
   1. Infundir 1.000 mL de solução salina estéril normal diretamente na cavidade abdominal antes do fechamento da ferida em pacientes submetidos a cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal.
      nota: As amostras foram obtidas de pacientes submetidos a gastrectomia, colectomia ou esofagectomia sem viés baseado em idade ou sexo. A solução salina foi transferida para um recipiente e despejada em todo o abdômen em um minuto. Isso é realizado rotineiramente como uma lavagem peritoneal pós-operatória sem efeitos significativos nos pacientes.
   2. Lave a cavidade abdominal extensivamente por pelo menos 1 min.
      nota: Recomenda-se que o fluido infundido seja agitado lentamente com as mãos do cirurgião para que as amostras fiquem uniformes.
   3. Recupere 200 mL de fluido de lavagem com quatro seringas de 50 mL.
      nota: Às vezes, um conector de borracha é usado para absorver os fluidos.
2. Realize a purificação do LDN peritoneal usando mAb específico de granulócitos, CD66b
   nota: Como a camada intermediária após a centrifugação do gradiente de densidade contém muitas células mononucleares, foi realizada uma seleção positiva de neutrófilos polimorfos usando mAb CD66b.
   1. Transferir o lavado peritoneal para um tubo de 50 mL.
      nota: Nesta etapa, passe os fluidos por um filtro de náilon de 100 μm para remover as impurezas.
   2. Centrifugue o líquido peritoneal a 270 x g durante 7 min à RT.
   3. Ressuspenda os pellets em 5 mL de PBS com 0,02% de EDTA.
   4. Sobreponha cuidadosamente os 5 ml de suspensão celular numa solução de gradiente de densidade de 3 ml.
   5. Centrifugue a 1.700 x g por 15 min em RT sem interrupções.
   6. Colha cerca de 2 a 3 mL de uma solução contendo as camadas intermediárias (Figura 1A) usando uma pipeta e misture com 10 mL de PBS com EDTA a 0,02%.
   7. Centrifugue o líquido peritoneal a 400 x g durante 7 min à RT e elimine o sobrenadante.
   8. Adicione mais 10 mL de PBS com 0,02% de EDTA e centrifugue a 270 x g por 7 min em RT. Descarte o sobrenadante.
   9. Dissolva o grânulo de célula (1 x 10⁷) em 60 μL de tampão para o kit de separação de células magnéticas.
   10. Adicione 20 μL de bloco Fc aos pellets e incube por 10 min a 4 °C.
   11. Adicione 20 μL do anti-CD66b conjugado com microesferas e incube por mais 10 min a 4 °C.
   12. Lave e ressuspenda os pellets em 500 μL de tampão MACS.
   13. Aplicar a suspensão de células a uma coluna magnética no campo magnético de um separador magnético adequado e recolher o fluxo contínuo contendo células CD66b(-) lavando a coluna com 15 ml de tampão.
   14. Remova a coluna do separador magnético e lave imediatamente as células CD66b(+) marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.
       nota: A população de células CD66b(+) consiste principalmente de neutrófilos, conforme determinado pela análise FACS, indicando que >95% da fração CD66(+) são positivas para CD11b, CD15 e CD16, mas negativas para CD14.

Figura 1: Formação de TNE após a cultura de LDN peritoneal. (UMA)Após a centrifugação do gradiente de densidade do lavado pós-operatório, as células recuperadas da camada intermediária são mostradas. (B) Em seguida, CD66b(+) LDN foram separadas das células mononucleares CD66b(-) e cultivadas em placas de 6 poços revestidas com poli-L-lisina, seguidas de adição de corante de coloração nuclear e observação imediata com microscopia de fluorescência. (C) O mesmo número de células mononucleares CD66b(-) foi cultivado nas mesmas condições. (D) A monocamada de LDN foi incubada com DNase I por 5 minutos antes da coloração nuclear. (E) CD66b(+) LDN foram cultivados em placas plásticas sem revestimento. As barras brancas representam 100 μm. Esta figura foi modificada de uma publicação anterior.