Microscopia de fluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs: uma técnica para observar a interação adesiva entre células cancerígenas e NETs

Resumo

Fonte: Kanamaru, R. et al. Armadilhas extracelulares de neutrófilos geradas por neutrófilos de baixa densidade obtidos do fluido de lavagem peritoneal medeiam o crescimento e a fixação de células tumorais. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a coloração fluorescente de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), os componentes do DNA extracelular expelidos pelos neutrófilos. Esta técnica permite a visualização da interação adesiva entre células cancerígenas e TNEs.

Protocolo

1. Coloração de células tumorais com corante ligante de células fluorescentes vermelhas

1. Prepare as linhas de células cancerígenas humanas MKN45, NUGC e OCUM-1.
2. Lave 1 x 10⁷ células com PBS + 0,02% EDTA em um tubo de 15 mL e centrifugue a 270 x g por 7 min em RT.
3. Adicione 1 mL de solução para coloração de corante aos pellets e pipete suavemente.
4. Dissolva 4 μL de corante Red Fluorescent Cell Linker em 1 mL de solução para coloração e misture com a suspensão celular da etapa 1.2.
5. Incube os pellets por 4 min em RT.
6. Adicione 4 mL de DMEM (10% FBS) para interromper a reação de coloração.
7. Centrifugar 270 x g durante 7 min e rejeitar o sobrenadante.
8. Repita as etapas 1.6 e 1.7 duas vezes.
9. Verifique com um microscópio de fluorescência (excitação = 551 nm, emitindo = 567 nm) se as células tumorais estão coradas de vermelho.

2. Análise da adesão de células tumorais a TNEs

1. Cultura de células neutrófilas de baixa densidade em uma placa revestida de poli-L-lisina de 6 poços (6 cm de diâmetro) por 2 h a 37 ° C em 5% de CO₂, o que permite a produção de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs
2. Transfira as células tumorais vermelhas coradas com fluorescência (1 x 10⁶) em 1 mL de RPMI 1640 suplementado com 0,1% de BSA.
3. Adicione as células tumorais à cultura de LDN que produziu os NETs.
4. Incubar por 5 min a 37 °C, o que permite que as células tumorais entrem em contato com os TNEs.
   nota: A incubação longa induz a adesão das células tumorais ao LDN ou às placas.
5. Remova o meio e lave suavemente os poços adicionando 2 mL de meio pré-aquecido (0.1% BSA + RPMI 1640) e girando o prato.
6. Repita o procedimento de lavagem na etapa 2.5 duas vezes.
   nota: Como os NETs se prendem fracamente à placa, a lavagem deve ser feita o mais suavemente possível para evitar a remoção dos próprios NETs.
7. Adicione corante fluorescente verde para corar o núcleo e os cromossomos a uma concentração final de 5 μg/mL para visualização dos TNEs.
8. Observe os TNEs e as células tumorais anexadas usando os filtros apropriados (verde, excitação = 504 nm, emissão = 523 nm; vermelho, excitação = 551 nm, emissão = 567 nm).
9. Mescle as figuras para mostrar as células tumorais que estão presas pelos TNEs.
   nota: Em alguns experimentos, a enzima de degradação do DNA foi adicionada à cultura de LDN (concentração final de 100 U/mL) 5 min antes da co-incubação por 5 min.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SYTOX green nucleic acid stain 5 mM solução em DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	S7020
Kit de ligação de célula fluorescente vermelha PKH26 para rotulagem geral de membrana celular	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	Pág. 9691
RPMI1640 Médio	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	R8758
Pó liofilizado de albumina de soro bovino, ≥96% (eletroforese em gel de agarose)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	A2153
MICROPLATE 6Well revestido com poli-L-lisina	IWAKI, Japão	Rolamento 4810-040
Estereomicroscópio de fluoresceína	BX8000, Keyence, Osaka, Japão	BZ-X710
Linha celular de câncer gástrico humano MKN45	Riken, Tukuba, Japão	N/A
Linha celular de câncer gástrico humano NUGC-4	Riken, Tukuba, Japão	N/A
Linha celular de câncer gástrico humano OCUM-1	Universidade da Cidade de Osaka, Japão	N/A	Presente do Dr. M. Yashiro
DNase I	Worthington, Lakewood NJ	LS002138
Solução 0,5 mol/l-EDTA (pH 8,0)	Tesque Nacalai, Japão	06894-14
Eagle modificado de Dulbecco Glicose média-alta (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	D5796