Microscopia de fluorescência de lapso de tempo de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs: uma técnica para analisar a interação pós-adesão entre células cancerígenas e TNEs

Resumo

Fonte: Kanamaru, R. et al. Armadilhas extracelulares de neutrófilos geradas por neutrófilos de baixa densidade obtidos do fluido de lavagem peritoneal medeiam o crescimento e a fixação de células tumorais. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, analisamos o comportamento pós-adesão de células cancerígenas presas em armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) por meio da co-cultura de neutrófilos de baixa densidade e células cancerígenas gástricas. A análise de vídeo com lapso de tempo ajuda a monitorar vários eventos celulares e estudar o papel dos TNEs em condições patológicas.

Protocolo

1. Análise de vídeo com lapso de tempo das células tumorais aprisionadas

1. Cultivar os LDN peritoneais numa placa redonda de 35 mm revestida com poli-L-lisina e incubar durante 2 h a 37 °C em CO₂% a 5%.
2. Adicione o corante verde-fluorescente para corar o núcleo e os cromossomos para visualizar NETs na concentração final de 5 μM.
3. Após 1 min de incubação, remova o meio e adicione 2 mL de BSA 0,1% + RPMI 1640.
4. Remova a mídia e adicione 1 x 10⁶ células MKN45 não coradas suspensas em 0.1% BSA + RPMI 1640. Incube por 5 min em RT.
5. Remova quaisquer células tumorais soltas lavando suavemente o prato, adicionando 2 mL de meio pré-aquecido (0,1% BSA + RPMI 1640) e girando o prato.
6. Repita o procedimento de lavagem acima duas vezes.
   nota: Como os NETs se prendem fracamente à placa, a lavagem deve ser feita o mais suavemente possível para evitar a remoção dos próprios NETs.
7. Adicione DMEM com 10% de FCS suplementado com 100 u / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina.
8. Monte a placa de cultura em um sistema de observação de células de visão completa e selecione o campo apropriado no qual as células tumorais são presas pelos NETs.
9. Continue a co-cultura por mais dois dias e tire fotos contínuas do campo a cada 6 minutos sob luz normal e fluorescência, que detecta células MKN45 e NETs, respectivamente.
10. Sobreponha as imagens em cada ponto de tempo e construa vídeos com lapso de tempo usando o software Image Viewer.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de coloração de ácido nucleico verde SYTOX 5mM em DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	S7020
RPMI1640 Médio	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	R8758
Eagle modificado de Dulbecco Glicose média-alta (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	D5796
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	D8537
Soro fetal bovino, regiões qualificadas e aprovadas pelo USDA	gibco by life technologies, México	Rolamento 10437-028
Pó liofilizado de albumina de soro bovino, ≥96% (eletroforese em gel de agarose)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	A2153
Penicilina estreptomicina	Life Technologies Japão	15140-122
Profilaxia com plasmocina	InvivoGen, San Diego, CA-EUA	formiga-mpp
Estereomicroscópio de fluoresceína	BX8000, Keyence, Osaka, Japão	BZ-X710
Sistema de observação de células de visão completa	Nikon, Kanagawa, Japão	BioStudio (BS-M10)
Linha celular de câncer gástrico humano MKN45	Riken, Tukuba, Japão	N/A