Preparação de bloqueio de exossomos: um protocolo para preservar exossomos de células de câncer de cólon humano cultivadas

Resumo

Fonte: Jung, M. K. et al. Preparação de amostras e imagens de exossomos por microscopia eletrônica de transmissão. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve a técnica de preparação de blocos de exossomos de células tumorais gastrointestinais cultivadas. Esses blocos de exossomos podem ser fatiados, corados e visualizados para determinar a posição de proteínas específicas na vesícula da bicamada lipídica.

Protocolo

1. Preparação em bloco de exossomos

1. Pulverizar os exossomas do sobrenadante de cultura de células HCT116 por centrifugação a 100.000 x g durante 1,5 h. Retirar o sobrenadante de cultura e fixar cuidadosamente o sedimento de exossoma purificado com 1 ml de glutaraldeído a 2,5% em solução de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,0) durante 1 h a 4 °C. Para o cacodilato de sódio 0,1 M, dissolver 4,28 g de ácido cacodílico em 160 mL de água destilada (DW). Ajustar o pH para 7,4 com HCl 0,1 M e, em seguida, completar até 200 ml com água destilada.
2. Remova o fixador e enxágue os pellets com 1 mL de tampão cacodilato de sódio 0,1 M à temperatura ambiente. Repita três vezes, com cada troca durando 10 min.
3. Pós-fixar a amostra com 1 mL de tetróxido de ósmio a 2% por 1 h a 4 °C.
4. Remova o fixador e enxágue três vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M a cada 10 min.
5. Incube por 10 min com uma série graduada de acetona (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectivamente) no agitador.
6. Remova a acetona e incube a solução de acetona 3:1: mistura de inclusão de baixa viscosidade por 30 min. O pelota do exossomo está no tubo.
7. Remova o meio e adicione acetona 1: 1: meio de mistura de incorporação de baixa viscosidade e incube por 30 min.
8. Remova o meio e adicione acetona 1:3: meio de mistura de incorporação de baixa viscosidade e incube por 30 min.
9. Remova o meio e adicione a mistura de incorporação de baixa viscosidade 100% e incube durante a noite em temperatura ambiente.
10. Incorpore a amostra em mistura de incorporação pura de baixa viscosidade usando o molde de incorporação e leve ao forno por 24 h a 65 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glutaraldeído	ems	16200
Cacodilato de sódio	ems	12300
Tetróxido de ósmio 1 g de cristal	ems	19100	Utilizar apenas em hottes
acetona	JUNSEI	1B2031