Imunomarcação de ouro de cortes exossômicos: uma técnica para visualizar marcadores diagnósticos no lúmen exossômico

Resumo

Fonte: Jung, M. K., Mun, J. Y. Preparação de amostras e imagens de exossomos por microscopia eletrônica de transmissão. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos a imunomarcação com ouro de biomarcadores localizados na região do lúmen de cortes exossômicos ultrafinos. Essa técnica permite o diagnóstico precoce de doenças pela visualização de moléculas-alvo dentro dos exossomos secretados pelas células doentes.

Protocolo

1. Imunocoloração de seções de exossomos e imagens

1. Preparar secções ultrafinas de 60 nm de um bloco de exossomas utilizando um ultramicrótomo e recolhê-las numa grelha de níquel.
2. Incubar as grades em gotas de 50 μL de glicina 0,02 M por 10 min para extinguir os grupos aldeídos livres.
3. Enxágü em 100 μL de DW três vezes cada por 10 min. Incube em temperatura ambiente por 1 h em PBS contendo 1% de BSA.
4. Incubar as grelhas em gotas de 50-100 μL de anticorpo anti-KRS (1:100 em PBS contendo 0,1% de BSA) durante 1 h (se necessário, este passo deve ser realizado a 4 °C durante a noite).
5. Lave as grades com cinco gotas separadas (50 μL) de PBS contendo 0,1% de BSA por 10 min cada.
6. Transferir as grelhas para gotas de anticorpo secundário durante 1 h (IgG anti-coelho conjugada com partículas de ouro de 10 nm (1:100) em PBS contendo 0,1% de BSA).
7. Lave as grades com cinco gotas separadas (50 μL) de PBS contendo 0,1% de BSA a cada 10 min.
8. Coloração dupla com acetato de uranila a 2% por 20 min em condições escuras e com citrato de chumbo de Reynold por 10 min, respectivamente.
9. Observe as grades sob microscopia eletrônica de transmissão a 80 kV.
10. Clique em "Adquirir" e, em seguida, clique em "Arquivo" e "Salvar como" no sistema de câmera CCD sob o TEM a 80 kV. O tempo de exposição seguiu as configurações automáticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetato de uranilo	ems	22400	Produto químico perigoso
Citrato de chumbo	ems	17900
Microscopia Eletrônica de Transmissão	Hitachi	H7600
Grade de cobre	ems	G200-
glicina	sigma	022K5404
Tampão fosfato salino	sigma	Pág. 4417
Albumina de soro bovino	Aurion	Rolamento 25557
Anticorpo anti-CD274 humano purificado (B7-H1, PD-L1)	BioLegend	Rolamento 329710	Montaria inteira Immumogold
Rato purificado IgG2b, κ Isotipo Ctrl	BioLegend	401202	Montaria inteira Immumogold (Controle)
2ª partícula de ouro conjugada IgG anti-rato 9-11 nm	sigma	G7652
Paraformaldeído	ems	Rolamento 19210