$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Congelamento e montagem muscular
- Mergulhe a metade inferior de um pequeno copo de plástico (50 mL) contendo isopentano em nitrogênio líquido. O isopentano está pronto para uso quando se torna ligeiramente viscoso e forma um laminado branco sólido que reveste o interior do béquer (temperatura: -160 °C).
nota: Sempre use ferramentas manuais de bronze ou alumínio que não faíscas. Evite respirar o vapor do produto. Use com ventilação adequada. Se lidar com um derramamento e ventilação for impossível ou impraticável, use um respirador adequado.
- Congele um meio de incorporação em um mandril (cortiça) mergulhando-o brevemente (10 s) em isopentano.
- Manuseie o músculo (por exemplo, o tibial ou gastrocnêmio) segurando-o pelo tendão, verticalmente em relação à rolha, para manter a orientação das fibras e permitir seções transversais.
- Posicione cuidadosamente a parte final do músculo fresco em cima do meio de incorporação congelado.
nota: O músculo vai grudar. É importante NÃO cercar completamente o músculo com meio de incorporação. Também é importante manter a orientação vertical para posterior determinação da área da seção transversal.
- Mergulhe o mandril com o músculo anexado no banho de isopentano (o tempo de congelamento usual é de 7 a 15 s, dependendo do tamanho e composição da amostra).
nota: A imersão na solução de congelamento não deve durar mais do que o necessário para congelar completamente a amostra. Congelar por muito tempo fraturará o bloco de tecido, enquanto um tempo muito curto causará a formação de cristais de gelo. Um espécime bem congelado será branco como giz.
- Depois de congelar a amostra, coloque-a em um pequeno saco plástico ou tubo de amostra (50 mL) e guarde-a imediatamente em um freezer a -80 °C ou em nitrogênio líquido.
2. Seccionamento muscular
- Defina a temperatura de trabalho da câmara interna do criostato para cerca de -23 °C.
- Deixe a amostra (previamente armazenada a -80 °C) se aclimatar à temperatura de trabalho (algumas horas devem ser suficientes).
- Corte várias seções de 8 μm de espessura da amostra (de preferência os músculos tibial anterior ou gastrocnêmio) e colete-as em lâminas de vidro.
nota: Corte a seção na região do meio da barriga do músculo. Além disso, por uma questão de precisão, corte as seções perpendicularmente ao eixo de montagem.
- Mantenha as lâminas de vidro dentro da câmara do criostato. Não os deixe descongelar se o objetivo for realizar estudos de IF/IHC ou coloração enzimática.
- Armazene as lâminas a -80 °C para análises posteriores.