Preparação de montagem inteira do intestino de camundongo: usando um dispositivo simples de incisão intestinal para preparar a montagem inteira

Resumo

Fonte: Yoneda, M. et al. Um dispositivo simples para preparar rapidamente montagens inteiras do intestino de camundongo. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos a preparação de toda a montagem do intestino do camundongo usando um dispositivo simples de incisão intestinal. As montagens resultantes são de qualidade superior e uniforme e podem ser usadas para análises histológicas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dispositivo

1. Usine a parte principal da base do dispositivo a partir de um bloco sólido de resina acetil de alta densidade, conforme descrito neste manuscrito. Em cada extremidade, crie tiras elevadas de 3 mm e peça a máquina com essas ranhuras de 2,5 mm para pegar as hastes (veja a Figura 1 e a Figura 2).
2. Faça hastes de aço inoxidável de 2,4 mm de diâmetro com extremidades arredondadas.
nota:A estrutura principal da tampa foi usinada em placa de duralumínio.

2. Uso do Dispositivo

1. Disseque o intestino delgado e o cólon da cavidade abdominal usando uma tesoura e dedos enluvados. Remova o mesentério segurando-o com uma pinça curva e puxando-o suavemente para longe do intestino.
2. Enxágue os intestinos com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS, pH 7,4) usando uma ponta de pipeta do tipo Gilson, que foi cortada em sua extremidade mais larga para que possa caber em uma seringa de plástico de 10 ou 20 mL luer.
3. Disponha o intestino delgado (SB) em uma folha de papel toalha e divida em três seções iguais de comprimento (proximal, médio e distal – SB1, SB2 e SB3) usando uma tesoura. Remova o ceco e coloque o cólon.
4. Faça vários cortes muito pequenos nos segmentos intestinais com uma tesoura para permitir que o fluido escape e coloque uma folha de papel toalha sobre os intestinos e passe suavemente um dedo sobre as preparações para espremer o fluido e secar.
5. Levantar as secções e inserir as hastes de aço inoxidável previamente humedecidas por imersão num copo de solução salina tamponada com fosfato.
   nota: O intestino pode ser invertido se assim o desejar (virado do avesso).
6. Rotule um pedaço de cartão ou papel de filtro cortado no tamanho certo para caber na base do dispositivo. O lápis é o melhor, pois não é afetado por praticamente todas as soluções. A data da autópsia, o código experimental e o número de identificação do animal são sugeridos.
7. Coloque o cartão ou papel de filtro na base do dispositivo. Insira as hastes e intestinos nas ranhuras na base do dispositivo. Certifique-se de que a extremidade proximal dos segmentos esteja posicionada de maneira padronizada. As extremidades proximais devem estar próximas às etiquetas dos cartões.
8. Coloque a parte superior do dispositivo sobre a base. Use as barras angulares para guiar uma lâmina de bisturi para cortar as seções longitudinalmente.
   nota: Ajuda se o tecido for segurado com cuidado e cuidado com um dedo para garantir que ele não se mova com a faca.
9. Remova a parte superior do dispositivo. Remova cuidadosamente o papel de filtro e os lenços de papel (ainda em suas hastes).
   nota: Um pedaço de cartão rígido colocado embaixo do papel de filtro ajudará a levantar.
10. Ligeiramente molhado (com a ponta do dedo enluvada mergulhada em PBS) os segmentos. Role a haste, de um lado para o outro, para abrir o intestino e espalhe-o. O tecido então aderirá ao papel de filtro.
11. Examine visualmente os preparativos para quaisquer lesões macroscópicas.
12. Transfira o tecido aderido ao papel de filtro para um banho raso (ou caixa de sanduíche) contendo um fixador.
    nota: Depois que o tecido aderir ao papel de filtro ou ao cartão, ele permanecerá firmemente preso. Uma ampla gama de fixadores pode ser usada para preservar a preparação. Recomenda-se que o fluido de Carnoy seja usado para o estudo da proliferação celular intestinal, que é a fixação ideal para os melhores métodos de proliferação celular; no entanto, formalina ou muitos outros fixadores também podem ser usados se outros pontos finais forem necessários.
13. Após a fixação (geralmente 3 h), transfira as preparações para etanol a 70%. As amostras podem então ser armazenadas até que sejam necessárias. As preparações podem ser estudadas presencialmente e/ou utilizadas para a preparação de amostras histológicas para H&E ou outras técnicas de coloração histológica, imuno-histoquímica e/ou hibridização in situ.
    nota: A fixação prolongada pode reduzir a reatividade imuno-histoquímica e/ou a reatividade da hibridização in situ. As caixas de sanduíche de polipropileno são ideais para armazenar um grande número de preparações.
14. Se necessário, os tecidos fixados dos vários segmentos intestinais podem ser transformados em «rolos suíços» e corados com toda a gama de métodos histológicos, incluindo os acima descritos. Para fazer um 'rolo suíço', os segmentos intestinais são removidos do papel de filtro, enrolados em um palito de coquetel ou palito, presos com um alfinete entomológico e processados para inclusão em cera.
15. Se necessário, core o tecido a granel com azul de metileno para visualizar focos de cripta aberrantes.
16. Marque os preparativos fixos à vontade.

Resultados

Figura 1. Fotos do dispositivo original.O dispositivo original foi construído a partir de várias peças de metal, preparadas à mão. (A) O dispositivo montado. (B) A parte superior do dispositivo foi removida para mostrar as hastes na posição.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Delrin	Ryan Plastics, Earls Barton, Reino Unido		Material semelhante de resina acetal de alta densidade seria suficiente
Placa de duralumínio	Suprimentos de metal Ltd, Park Road, Dukinfield. SK16 5LP Reino Unido		O alumínio permite que remonta a 1909, portanto, fornecedores alternativos estão disponíveis
Dispositivo(s) acabado(s) pronto(s) para uso	Entre em contato com o Dr. Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk		Entre em contato r.goodlad@imperial.ac.uk para obter detalhes sobre o fornecimento