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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Soluções
- Conforme descrito na Tabela 1, prepare o tampão de cólon, o meio de separação de densidade à base de sílica 100%, o meio de separação de densidade à base de sílica 66%, o meio de separação de densidade à base de sílica 44%, o tampão de digestão de colagenase E e o tampão FACS.
- Prepare o tampão de cólon no dia anterior ao procedimento e armazene durante a noite a 4 °C.
- Prepare o meio de separação de densidade 100% à base de sílica no dia anterior ao procedimento e armazenado durante a noite a 4 °C, colocando-o em temperatura ambiente na manhã do procedimento para descongelar.
- Prepare os meios de separação à base de sílica a 66% e 44% na manhã do isolamento, usando meios de separação de densidade à base de sílica 100% à temperatura ambiente e tampão de cólon.
- Meça a quantidade apropriada de colagenase E derivada de Clostridium histolyticum e armazene a -20 ° C durante a noite antes do procedimento. Na manhã seguinte, dissolva no volume apropriado de tampão de cólon para derivar o tampão de digestão da colagenase. Para todas as incubações com tampão de digestão de colagenase no dia do procedimento, pré-aqueça as soluções a 37 ° C.
- Durante todas as etapas do protocolo, manter uma centrífuga a 20 °C e velocidade de rotação de 859 x g, com os travões desativados (desaceleração 0) para centrifugação em declive. Definir outro para 4 °C e velocidade de rotação de 859 x g, com a desaceleração padrão, para as etapas de lavagem.
2. Colhendo o cólon
- Eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2 seguida de método confirmatório aprovado pela AALAC.
- Coloque o mouse em decúbito dorsal e borrife o pelo com etanol a 70%. Usando uma tesoura de tecido grande, faça uma incisão vertical na linha média e exponha o peritônio intacto.
- Usando uma tesoura de dissecção fina, abra o peritônio. Use uma pinça para mover o intestino delgado para um lado e expor o cólon descendente. Puxe levemente para cima o cólon descendente para expor ao máximo a porção retal do cólon. Corte o reto distal profundamente na pelve e disseque e remova todo o cólon como uma unidade, do reto distal à capa cecal.
- Transfira o cólon em 20 mL de tampão de cólon resfriado em um tubo de polipropileno de 50 mL.
3. Limpando o cólon
- Coloque o cólon em uma toalha de papel umedecida e extraia as fezes sólidas aplicando uma leve pressão na parede intestinal com a ponta romba de uma tesoura ou fórceps.
- Coloque o cólon em uma placa de Petri e lave o intestino com 10 mL de tampão de cólon resfriado usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de enchimento rombo de 18G.
- Transfira o cólon para uma toalha de papel umedecida com colchão de cólon e remova o mesentério e a gordura com a ponta afiada da tesoura.
- Coloque o cólon em uma placa de Petri cheia de 5-10 mL de tampão de cólon resfriado, agitando manualmente para lavar o conteúdo colônico restante. Repita 2-3 vezes.
- Corte o cólon longitudinalmente de sua extremidade retal mais muscular até o cólon proximal (gerando um único pedaço retangular de cólon aberto) em uma placa de Petri cheia de tampão de cólon fresco e resfriado. Descarte a mídia existente e reabasteça com o tampão de cólon limpo e resfriado.
- Lave o intestino 3 vezes, girando-o vigorosamente na placa de Petri e substituindo os 5-10 mL de Colon Buffer resfriado após cada lavagem.
- Coloque o tecido retangular do cólon em uma toalha de papel umedecida com Colon Buffer e corte-o cortando-o horizontalmente e depois em pequenos fragmentos (seções de 3 mm x 3 mm).
- Colete os fragmentos de cólon cuidadosamente usando uma pinça fina em 20 mL de tampão de cólon resfriado em um tubo cônico de polipropileno de 50 mL.
- Lave os fragmentos de cólon três vezes, cada lavagem em 20 mL de tampão de cólon, girando vigorosamente o tubo por 30 s. Entre cada agitação, permita que os fragmentos de tecido se depositem no fundo do tubo. Decantar ou aspirar a vácuo o sobrenadante, evitando a perda de fragmentos de tecido no processo de aspiração entre cada lavagem.
nota: Não há necessidade de trocar o tubo após cada lavagem.
4. Digestão da colagenase 1
- Adicione 20 mL do tampão de digestão da colagenase aos fragmentos de cólon lavados no tubo cônico de polipropileno de 50 mL.
- Coloque o tubo fechado de 50 ml a 37 °C num agitador orbital incubado com a taxa de rotação definida em 2 x g durante 60 min. Certifique-se de que os fragmentos de tecido estão em movimento constante durante a agitação; se necessário, aumente a taxa de rotação gradualmente para garantir que nenhum fragmento de tecido se deposite no fundo do tubo.
5. Preparar gradientes de meios de separação à base de sílica
- Prepare meios de separação de densidade à base de sílica 66% e 44%, usando meios de separação de densidade à base de sílica 100% a 20 °C (temperatura ambiente) e tampão de cólon.
- Despeje 5 mL de meio de separação de densidade à base de sílica a 66% em cada um dos 3 tubos de polipropileno separados de 15 mL. Prepare três tubos por cólon. Isso forma a base de maior densidade do procedimento de isolamento de gradiente, na qual a mídia de separação de baixa densidade será colocada em camadas para criar o gradiente de separação.
- Conservar a 20 °C até à utilização.
6. Coleta de sobrenadante da digestão 1
- Colete apenas o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 25 mL e filtre o sobrenadante através de um filtro de células de tecido de filtração de poros de 40 μm colocado em um tubo cônico de polipropileno limpo de 50 mL, após a conclusão da digestão da colagenase 1. Tenha cuidado para não aspirar nenhum fragmento de tecido existente.
NOTA: Retenha quaisquer fragmentos de tecido visíveis restantes no tubo. Estes serão submetidos à segunda digestão da colagenase (etapa 8).
7. Têmpera do tampão de digestão da colagenase
- Encha o tubo de polipropileno de 50 mL completamente com o Buffer de Cólon resfriado.
nota: A colagenase é ativa a 37 °C; portanto, o tampão resfriado inativa essa enzima.
- Centrifugar o tubo a 4 °C a 800 x g durante 5 min.
- Rejeitar o sobrenadante por aspiração a vácuo. Lave as células com 25 mL de tampão de cólon fresco e centrifugue a 800 x g por 5 min.
- Ressuspenda o pellet em menos de 1 mL de tampão de cólon fresco e resfriado.
- Coloque o tubo cônico de polipropileno de 50 mL no gelo.
8. Digestão da colagenase 2
- Repita a etapa 4 (Digestão 1) com os fragmentos de tecido restantes retidos da etapa 6.1.
9. Desagregação tecidual após digestão 2
- Lave os fragmentos de tecido vigorosamente para frente e para trás entre o tubo e uma seringa de 10 mL através de uma agulha de ponta romba de 18G.
- Repita esta descarga por um mínimo de 7-8 passagens completas, continuando até que nenhum fragmento de tecido grosseiro ou detritos seja visível.
10. Filtrar células
- Passe a suspensão de desagregação de tecido através de um filtro de células de tecido de filtração de poros de 40 μm em um tubo de polipropileno limpo de 50 mL.
- Lave o filtro de células do tecido de filtragem com 10 mL de tampão de cólon resfriado para recuperar quaisquer células presas no filtro.
11. Extinguindo a digestão da colagenase
- Encha o tubo cônico de polipropileno de 50 mL até a borda com o tampão de cólon resfriado.
NOTA: A temperatura do tampão do cólon é crítica para garantir a extinção da atividade da colagenase.
- Gire a 4 °C e 800 x g por 5 min.
- Rejeitar o sobrenadante por aspiração a vácuo.
- Lave ressuspendendo em 25 mL de tampão de cólon fresco e resfriado, seguido de centrifugação a 4 ° C, 800 x g por 5 min.
- Rejeitar o sobrenadante por aspiração a vácuo.
- Agrupe o pellet ressuspenso da Digestão da Colgenase 1 (etapa 7) para o tubo correspondente da etapa 11.4.
- Repita a etapa 11.4 (lavagem e centrifugação).
12. Separação de gradiente de mídia de separação de densidade à base de sílica
NOTA: Execute as etapas 12 a 13 o mais rápido possível para garantir a extinção rápida da atividade da colagenase.
- Seguindo a etapa 11.7, ressuspenda cada pellet em um total de 24 mL de 44% de meios de separação de densidade à base de sílica por cólon.
- Coloque lentamente 8 mL do meio da etapa 12.1 em cada um dos três tubos preparados na etapa 5.2 (contendo 66% de meios de separação de densidade à base de sílica), usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Mantenha um fluxo constante e lento da mídia de separação de densidade de 44% enquanto sobrepõe o gradiente para evitar a interrupção da interface.
- Equilibre cuidadosamente todos os tubos dentro dos baldes da centrífuga usando uma balança ou balança.
- Girar os tubos 20 min a 859 x g numa centrífuga sem travão a 20 °C. Deixar os rotores irem completamente em repouso antes de remover os tubos, tendo o cuidado de não perturbar as células na interface gradiente.
13. Coletar células mononucleares da interface de gradiente
- Visualize a interface de gradiente (perto da marca de 5 mL), onde normalmente uma faixa branca de 1-2 mm de espessura (contendo MNC) está presente.
nota: Pode-se ou não ver uma faixa branca. No entanto, o MNC estará nessa interface e deve obscurecer a clareza da interface de gradiente.
- Aspire a vácuo e descarte os 7 mL superiores do gradiente superior para permitir um acesso mais fácil da pipeta à interface.
- Usando sucção manual contínua e movimento rotativo constante do pulso, colete a camada de interface das células em um tubo cônico de polipropileno limpo de 50 mL. Colete até que a interface entre os dois gradientes esteja clara e refratária (livre de células).
- Encha o tubo de coleta com 50 mL de tampão FACS resfriado. Centrifugar a 4 °C, 800 x g durante 5 min.
- Aspire o sobrenadante por aspiração a vácuo e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão FACS.
- Conte as células em um hemocitômetro em uma diluição de 1:2 usando métodos apropriados de exclusão de células mortas.
- Prossiga para a coloração FACS ou outros ensaios com MNC colônico recém-isolado.
Tabela 1: Tabela de preparação da solução
| solução | fórmula |
| Amortecedor de cólon | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (inativado por calor a 56oC por 60 minutos, pH ajustado para 7,3) |
| Mídia de gradiente de densidade à base de sílica 100% (por dois pontos) | 22,5 mL de meio gradiente de densidade à base de sílica + 2,5 mL de 10x PBS. |
| Mídia de gradiente de densidade à base de sílica 66% (por cólon) | 10,72 mL de mídia gradiente de densidade à base de sílica 100% + 5,28 mL de tampão de cólon |
| Mídia de gradiente de densidade à base de sílica 44% (por cólon) | Mídia de gradiente de densidade à base de sílica de 11 mL 100% + 14 mL de tampão de cólon |
| Tampão de digestão de colagenase (por cólon) | 100 U/mL de colagenase E de Clostridium histolyticum, dissolvido em 40 mL de tampão de cólon |
| Buffer FACS | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g de azida sódica |