Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Estabelecimento de organoides fúndicos gástricos 3D derivados de humanos
NOTA: Para evitar contaminação, execute o protocolo em sua totalidade dentro de uma capa de cultura de tecidos estéril. O tecido fúndico humano foi coletado de pacientes submetidos à gastrectomia vertical.
- Colete o tecido de pacientes submetidos a gastrectomia vertical e coloque-o na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) gelada sem Ca2+/Mg2+ em um grande recipiente de plástico.
- Com uma pinça, lavar vigorosamente o tecido num copo estéril contendo 100 ml de DPBS isento de Ca2+/Mg2+. Lave por aproximadamente 30 s ou até que os detritos e o sangue tenham sido removidos. Em seguida, usando gaze estéril, limpe a camada mucosa do epitélio.
- Usando uma pinça grande, segure firmemente a camada muscular do tecido e, com força, raspe o epitélio usando a grande pinça hemostática curva. Colete os fragmentos epiteliais raspados em uma placa de Petri estéril de poliestireno.
- Pique o tecido epitelial em fragmentos de aproximadamente 2,0 x 2,0 mm detamanho 2 usando lâminas de barbear para otimizar a digestão do tecido. Lave os fragmentos de tecido com DBPS livre de Ca2+/Mg2+ suplementado com antibióticos (DPBS livre de Ca2+/Mg2+, penicilina/estreptomicina a 1%, 0,25 mg/mL de anfotericina B/10 mg/mL de gentamicina, 50 mg/mL de canamicina), até que a lavagem esteja livre de sangue. Realize várias lavagens, se necessário. Descarte a lavagem filtrando-a cuidadosamente através de uma gaze estéril em um copo de resíduos.
- Colete os fragmentos lavados em um frasco de fundo redondo de vidro de 125 mL com uma barra de agitação de 25 mm e meio de incubação pré-aquecido (meio basal suplementado com 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 10 mM de tampão HEPES, 1 mg/mL de colagenase tipo 1, 2 mg/mL de albumina de soro bovino para cultura de células). Fechar o balão de fundo redondo com septos de borracha.
- Insira uma agulha espinhal 20G nos septos e conecte-a a um tanque de oxigênio com mangueira de borracha. Para filtrar quaisquer contaminantes, insira papel de seda na tubulação para criar um filtro. Ligue o fluxo de saída de oxigênio em baixa. Insira 10–15 agulhas de saída nos septos para evitar a ruptura dos septos.
- Prenda o conjunto a um suporte de anel usando clamps e coloque-o em um banho-maria calibrado para 37 ° C com uma placa de agitação por 30–45 min. Após o tecido ter sido incubado por 15 min, remova 50 μL de meio de incubação e verifique visualmente se há glândulas dissociadas. Se as glândulas não forem densas ou não se separarem do tecido, deixe por mais 5 a 10 minutos.
- Imediatamente após a incubação, adicione 50 mL de DMEM/F-12 pré-aquecido ao meio de incubação usando uma pipeta sorológica estéril ou despejando diretamente na mistura de incubação.
- Filtre a mistura de glândulas através de uma gaze estéril em quatro tubos cônicos de 50 mL. Mantenha o filtrado no gelo por 15 min para permitir que as glândulas extraídas se depositem no fundo do tubo cônico. Tenha cuidado para não perturbar as glândulas estabelecidas; remova e descarte os 40 mL superiores de sobrenadante usando uma pipeta sorológica. Ressuspenda os 10 mL restantes em 10 mL de DPBS suplementado com antibióticos.
- Distribua a mistura uniformemente em tubos de ensaio de cultura de células de 5 mL. Centrifugue durante 5 min a 65 x g a 4 °C e retire cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.
nota: É crucial realizar esta etapa no gelo e evitar a polimerização da matriz da membrana basal durante a mistura. Além disso, é importante inspecionar visualmente a densidade da glândula por amostragem de 50 μL. A densidade ideal é de ~ 70% de confluência.
- Em seguida, plaquear as glândulas em 50 μL da matriz da membrana basal usando uma pipeta de ponta larga. Evite produzir bolhas durante o revestimento.
- Para permitir que a matriz da membrana basal polimerize, incube por 10 a 15 min a 37 °C. Se estiver em uma placa de cultura de 12 poços, adicione 1 mL de meio hFGO (meio Eagle modificado de Dulbecco avançado / meio F-12 suplementado com 2mM L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 0,25 mg / mL de anfotericina B / 10 mg / mL de gentamicina, 50 mg / mL de canamicina, 10 mM de tampão HEPES, 1 mM de n-acteilcistina, 1 x N2, 1 x B27, 50% de meio condicionado por Wnt, 20% de meio condicionado por R-espondina suplementado com 100 ng/mL de inibidor de proteína morfogenética óssea, gastrina 1 nM, fator de crescimento epidérmico de 50 ng/mL, fator de crescimento de fibroblastos 10 ng/mL de 200 ng/mL, nicotinamida 10 mM e inibidor de ROCK Y-27632 de 10 μM) por poço. Se não estiver usando uma placa de cultura de 12 poços, adicione mídia suficiente para submergir a bolha da matriz da membrana basal.
- Cultivar as células a 37 °C em uma incubadora de cultura de células umidificadas com 5% de CO2. Troque de mídia a cada 4-5 dias.
