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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de instrumentos, meios de cultura e pratos
- Autoclave um conjunto de tesouras intestinais, tesouras normais e pinças em um recipiente estéril.
- Coloque um prato de 96 poços (fundo plano) em uma incubadora a 37 ° C.
- Prepare 10 mL de meio de cultura completo com os reagentes listados na Tabela de Materiais.
- Incubar o meio completo a 37 °C em banho-maria.
- Descongele a membrana basal reconstituída colocando-a em um balde de gelo. A membrana basal reconstituída se tornará líquida a 4 ° C .
- Encha quatro placas de Petri com solução salina tamponada com fosfato frio ou PBS (4 °C).
2. Isolamento de criptas intestinais delgadas
- Sacrifício por inalação de CO2 em um camundongo Lgr5-eGFP-IRES-CreER t2 em um fundo C57BL6 / J. Disseque o peritônio longitudinalmente com uma tesoura.
- Segure o estômago com a pinça e corte-o transversalmente ao meio.
- Usando a tesoura intestinal a partir de agora, retire o intestino e coloque-o em uma placa de Petri contendo PBS.
nota: As tesouras intestinais têm uma ponta afiada e romba. A ponta romba dessas tesouras destina-se a não danificar a arquitetura das vilosidades da cripta ao abrir o intestino.
- Comece colocando a ponta romba no estômago e empurre-a suavemente através do piloro. Prossiga cortando com a tesoura e puxando com a pinça.
- Uma vez que todo o intestino delgado esteja aberto longitudinalmente, lave-o em PBS frio, segurando-o com a pinça e enxágue-o suavemente na solução de PBS com movimentos em forma de U.
- Depois que todos os restos de fezes forem removidos, prossiga para achatar o intestino em uma tábua de cortar, com o lado luminal para cima. O lado luminal é facilmente reconhecível pela ausência de vasos sanguíneos e pela sua aparência pálida quando comparado com a parte externa.
- Com uma lâmina de vidro, remova suavemente as vilosidades raspando o intestino achatado. Execute esta etapa duas vezes ao longo de todo o comprimento do tecido.
- Corte o intestino delgado com uma lâmina cirúrgica estéril em pedaços de 2 a 5 mm.
- Coloque os fragmentos do intestino delgado em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de PBS gelado.
- Limpe os fragmentos de tecido, removendo quaisquer impurezas restantes, pipetando-os para cima e para baixo no PBS. Rejeitar o sobrenadante e repetir este passo até que o PBS esteja completamente limpo.
- Adicione 15 mL de PBS frio para elevar o volume final total de PBS para 25 mL. Adicionar 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar durante 45 min num rolo a 4 °C.
- Descarte o PBS / EDTA.
- Adicione 10 mL de PBS e retire as criptas pipetando duramente os fragmentos de tecido para cima e para baixo (pelo menos três vezes). Colete o sobrenadante.
- Repita a etapa 2.13 quatro vezes. Adicionar meio de cultura até atingir um volume final de 50 mL.
- Pulverize as células por centrifugação (300 x g por 5 min).
- Ressuspender o pellet em 10 mL de meio de cultura e pellet as criptas por centrifugação (80 x g por 3 min).