Isolamento de colônia de células cancerígenas metastáticas de CAM de galinha: um procedimento para isolar células cancerígenas de culturas de ovos sem casca

Resumo

Fonte: Stoletov, K. et al. Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioalantóide intravital rápida e quantitativa de Chick. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, descrevemos o isolamento de colônias de células cancerígenas metastáticas da membrana corioalantóide (CAM) de galinha usando cultura de ovos sem casca. Este método ajuda a rastrear fatores que podem ser responsáveis pela metástase do câncer.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Isolamento de colônias metastáticas

1. No dia 5 após a injeção, remova os embriões da incubadora e inspecione os CAMs do embrião quanto à distribuição metastática da colônia. Identifique os embriões com distribuição uniforme de colônias nas quais colônias compactas (ou excessivamente invasivas) estão presentes.
   nota: O processo de cultura de embriões de galinha não é estéril, portanto, todas as etapas de triagem devem ser realizadas em condições altamente limpas para evitar contaminação futura da cultura de tecidos. A contaminação é bastante rara e pode ser facilmente evitada usando luvas e máscara e usando apenas ferramentas estéreis durante os procedimentos de injeção de células e isolamento de colônias. Recomenda-se inspecionar os embriões um a um para diminuir sua exposição à temperatura ambiente do laboratório e evitar contaminação.
2. Localize a colônia metastática de interesse. Uma colônia compacta pode ser descrita como aquela com a maioria das células cancerígenas localizadas dentro de uma área limitada no tecido CAM (as células parecem "agrupadas"). Uma colônia invasora pode ser descrita como uma colônia onde as células cancerígenas "se espalham" no tecido CAM (Figura 1A, B).
   NOTA: A "compactação" da colônia metastática pode ser explicada pela inibição da invasão de células cancerígenas, inibição da proliferação de células cancerígenas ou ambas. Deve-se prestar atenção a todos os cenários e as colônias de contato devem ser isoladas (Figura 1A, B). Um estereomicroscópio fluorescente simples pode ser usado para discriminar entre fenótipos de colônias metastáticas compactas e invasivas.
3. Sob o microscópio de dissecação, puxe suavemente o tecido CAM que contém a colônia metastática de interesse para cima usando uma pinça fina (Figura 1C).
4. Corte o tecido CAM que contém a colônia metastática usando uma tesoura cirúrgica.
5. Transfira o tecido CAM que contém a colônia metastática para um tubo vazio e estéril de 1,5 mL (no gelo) e feche a tampa do tubo.
   nota: As colônias isoladas podem ser mantidas no gelo por até 3 h sem perda de viabilidade.
6. Repita o procedimento de excisão até que todas as colônias de interesse sejam coletadas em tubos separados. Para evitar o sofrimento animal, não extirpar mais de 2 a 3 colônias de um embrião. Eutanasiar embriões congelando a -20 °C (ou outro método aprovado) imediatamente após a excisão da colônia.
7. Pique suavemente o tecido CAM em um tubo de microcentrífuga usando uma agulha 18G estéril. Use uma agulha separada para cada colônia.
8. Adicione 100 μL de solução de colagenase 1x e incube por 30 min a 37 °C.
9. Gire as células e o tecido CAM a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente.
10. Aspirar a solução de colagenase e ressuspender as células em meio completo utilizado para a linhagem celular de interesse.
    nota: Normalmente, o tecido CAM não é completamente dissociado após o tratamento com colagenase, e as células cancerígenas proliferam primeiro dentro dos pedaços de tecido CAM e só depois migram para a placa de cultura de tecidos.
11. Gire as células e o tecido CAM novamente a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente.
12. Ressuspenda as células e pedaços de tecido CAM em 1 mL de meio completo mais fator de seleção (se houver) e, em seguida, transfira para uma única placa de cultura de tecidos de 12 poços.
    nota: Os fibroblastos CAM de galinha podem persistir na cultura de tecidos por múltiplas passagens, inibindo a expansão clonal. A capacidade de expandir as colônias metastáticas na presença de um fator de seleção (ou seja, se um vetor que foi usado para tornar as células cancerígenas fluorescentes também codifica um gene de resistência a antibióticos de mamíferos) pode acelerar muito a expansão clonal. Um experimento de curva de morte deve ser realizado antes da triagem para garantir que a concentração adequada de antibióticos seja usada.
13. Nas próximas 1 a 3 semanas, monitore as células cancerígenas diariamente quanto ao crescimento e contaminação.
14. Quando as células atingirem 70–80% da confluência, transfira as células para uma placa de cultura de maior volume.
    nota: Recomenda-se expandir as células até que pelo menos dois frascos criogênicos de cada clone possam ser congelados. Manter grandes quantidades de cultura de tecidos pode ser trabalhoso e desnecessário.
15. Prossiga para o sequenciamento ou próxima rodada de seleção assim que um número suficiente de células cancerígenas for alcançado. Geralmente, 1 x 10⁶ de células cancerígenas são suficientes para técnicas modernas de sequenciamento de alto rendimento.
16. Prossiga para a reinjeção do clone e imagem e quantificação da compactação da colônia ou contato entre células e vasos sanguíneos cancerígenos (Figura 2A). Como alternativa, prossiga para o sequenciamento de alto rendimento ou repita a seleção de colônias.
    NOTA: Para diminuir o número de falsos positivos, recomenda-se pelo menos duas rodadas de seleção. Duas abordagens foram empregadas com sucesso. 1) Expanda cada clone e reinjete individualmente para confirmar o fenótipo da colônia. 2) Misture todos os clones expandidos na proporção de 1:1 cada, reinjete como uma mistura e repita o ciclo de seleção.

Resultados

Figura 1. Resultados representativos para diferentes etapas do protocolo de triagem.(A) Colônias metastáticas formadas por células HEp3 heterogêneas (células HEp3 da linha de células cancerígenas transduzidas pela biblioteca), 5 dias após a injeção. A seta vermelha mostra a colônia compacta (potencial acerto positivo) que deve ser excisada. (B) Colônias m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL.	Corning	CLS430791-500EA
18 calibre x 1 1/2 BD precisão agulha	Bd	BD305196	nós usamos 1.2mm x 40mm, é possível usar agulhas mais curtas, se preferir
Centrífuga de bancada.	Muitas fontes estão disponíveis		Qualquer centrífuga compatível com TC que pode ser usado para girar para baixo as células is adequado
Colagenase	sigma	C0130-100MG
cotonetes	Muitas fontes estão disponíveis		deve ser esterilizado antes do uso
Meios de cultura apropriados para a célula linhas usadas	Muitas fontes estão disponíveis		Cultivamos células HT1080, HEp3 e b16 linhas em DMEM, 10% de mídia FBS
Incubadora de ovos	Muitas fontes estão disponíveis		Um modelo exato que é necessário depende da escala da tela. As fontes disponíveis são MGF Company Inc., Savannah, GA ou Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
Tubos Eppendor, 1,5 ml	sigma	T4816-250EA
Ovos de Leghorn Branco fertilizados	qualquer fornecedor local
fórceps fino	Muitas fontes estão disponíveis		deve ser esterilizado antes do uso
Software de análise de imagens			Usamos Nikon Elements
PBS (1x)	Muitas fontes estão disponíveis
Pratos de pesagem em plástico	Importação	CA11006-614	As dimensões são 78x78x25mm; muitos Outras fontes estão disponíveis
tesoura cirúrgica pequena	Muitas fontes estão disponíveis		deve ser esterilizado antes do uso
Microscópio fluorescente estéreo			Usamos Zeiss Lumar v12