Isolamento e cultura de células epiteliais da língua murina: um procedimento para isolar e cultivar células epiteliais da língua a partir de modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Prasad, M. et al. Estabelecimento in vitro de uma linha celular de câncer de cabeça e pescoço murino geneticamente modificada usando um sistema Adeno-Associated Virus-Cas9. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, descrevemos o isolamento de células epiteliais de uma língua murina. Essas células podem ser cultivadas posteriormente para dar origem a colônias de células.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Isolamento e Cultura de Células Primárias

1. Eutanasiar um B6 macho ou fêmea de 6 semanas; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia por CO₂ ou qualquer outro protocolo aprovado pela IACUC.
   nota: Esses camundongos knockin CRISPR / Cas9 têm expressão dependente de Cre recombinase de endonuclease cas9 e EGFP dirigida por um promotor CAG. A sequência Lox-Stop-Lox (LSL) a montante presente no genoma desses camundongos impede a expressão de Cas9 e EGFP na ausência de Cre recombinase. Quando usados em combinação com RNAs guia únicos (sgRNAs) e uma fonte Cre, eles permitem a edição de genes de camundongo únicos ou múltiplos in vivo ou ex vivo.
2. Disseque a língua dos camundongos sacrificados usando uma tesoura cirúrgica.
3. Dissocie manualmente o tecido picando o tecido da língua em fragmentos muito pequenos usando um bisturi. Colete os fragmentos de tecido em um tubo de 15 mL contendo 4,5 mL de meio RPMI simples (sem soro).
4. Adicione a mistura tripla de enzimas (200 μL) (consulte a Tabela 1 para a receita) aos fragmentos de tecido.
5. Incubar a mistura tecido-enzima a 37 °C durante 30 min e bater no tubo de 10 em 10 min para aumentar a dissociação enzimática do tecido.
6. Adicione 5% de soro fetal bovino (FBS) contendo HBSS/PBS à mistura tecido-enzima para interromper a ação enzimática.
7. Filtrar a suspensão celular acima referida através de uma malha de nylon estéril de 70 μm para separar as células dispersas e os fragmentos de tecido maiores.
8. Lavar a suspensão filtrada por centrifugação durante 300 x g durante 5 min em HBSS/PBS à RT.
9. Ressuspender o pellet em meio de cultura (10% FBS em RPMI/DMEM) e crescer em placas de cultura de 60 mm até que se formem colónias celulares distintas.
   1. Os agregados de células de cultura são retidos no topo do filtro em uma placa de cultura de 60 mm contendo 3 mL de meio completo (10% de FBS em RPMI/DMEM) até que as colônias de células sejam formadas.
10. Examine microscopicamente as células primárias quanto à presença de contaminação por fibroblastos após 1 semana de cultura. Trate as células primárias desenvolvidas a partir de agregados e suspensões celulares com solução de EDTA 0,25 tripsina 0,02% a 37 °C por 1 min para remover fibroblastos.
    nota: Normalmente, a cultura primária de agregados celulares produz mais colônias em comparação com suspensões unicelulares. As células dessas colônias fornecem melhor eficiência de transdução com a transdução de AAV.

Solução de estoque de enzima tripla 10X:
Colagenase	1 g de concentração final [10 mg/mL]
Hialuronidase	100 mg [1 mg/ml]
DNase	20.000 Unidades conc. final [200 mg/mL]
PBS 1X	Completar até 100 ml

Tabela 1: Receita de tampão usada neste estudo

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cepas de camundongos
C57BL/6	Envigo
B6; 129-GT (ROSA) 26Sortm1 (CAGcas9 *, -EGFP) Fezh / J	Laboratórios Jackson	Rolamento 24857
aceno. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	Envigo
Enzimas
Benzonase	sigma	E1014
Colagenase IV	Thermo Fisher Científico	17104019
DNAse	Thermo Fisher Científico	18047019
Hialuronidase	MilliporeSigma	H3506
tripsina	Indústrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	03-050-1B
Meios de Cultura, Produtos Químicos e Reagentes
Bsa	Amresco	0332-TAM-50G
DMEM	Indústrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	01-055-1A
FBS	Indústrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	04-127-1A
HBSS	sigma	H6648
Pbs	Indústrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	02-023-1A
Amortecedor Tris	MERCK Millipore	Nº 648311-1KG
Mercadorias de plástico
Filtro Amicon-ULTRA 100 KDa	Millipore	UFC910024
Filtros estéreis de 0,22 μm, 4 mm	Millex	SLGV004SL
Filtros estéreis de 0,45 μm, 13 mm	Millex	SLHV013SL
Placas de cultura	Greiner Bio-One
Tubos de falcão	Greiner Bio-One