Pré-tratamento de tecido FFPE para RNA CISH: um procedimento para processar seções de tecido embebidas em parafina fixadas em formalina para hibridização in situ cromogênica de RNA

Resumo

Fonte: Outh-Gauer, S. et al. Hibridização In Situ Cromogênica como Ferramenta para o Diagnóstico de Câncer de Cabeça e Pescoço Relacionado ao HPV. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra as etapas envolvidas no pré-tratamento de amostras de tecido FFPE para hibridização in situ cromogênica de RNA. O processo de pré-tratamento ajuda a manter a integridade do ácido nucleico dentro das células e a morfologia geral do tecido.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação dos Materiais

1. Preparação de 1x reagente de recuperação de alvo
   1. Em um béquer grande, adicione 70 mL de reagente de recuperação alvo 10x (consulte a Tabela de Materiais) a 630 mL de água destilada.
   2. Coloque o copo sobre uma placa de aquecimento com um agitador magnético. Cubra-o com papel alumínio.
   3. Ferva seu conteúdo a 100 °C por 10–15 min.
      NOTA: Não deixe ferver por mais de 30 min.

2. Pré-tratamento de tecidos

NOTA: Essas etapas seguem a recomendação de pré-tratamento "padrão" de acordo com as instruções do fabricante para amostras de cabeça e pescoço. O tempo das secções 2.1 e 2.2 pode ter de ser ajustado em função do tecido manipulado.

1. Bloqueio da atividade da peroxidase
   1. Adicione 4-6 gotas de peróxido de hidrogênio (consulte a Tabela de Materiais) a cada lâmina e incube-as por 10 min em temperatura ambiente.
   2. Lave as lâminas 2x por 2 min em água destilada em temperatura ambiente.
2. Quebra de ligações de RNA/tecido
   1. Com uma garra, remova a folha de alumínio do reagente de recuperação de alvo 1x em ebulição (TTR1x) colocado em uma placa de aquecimento e pare de mexer. Mergulhe o suporte deslizante lentamente e com muito cuidado por 15 min. Cubra o béquer novamente com papel alumínio.
      nota: A fervura deve persistir durante esta etapa.
      cuidado: Use a garra para manipular a folha de alumínio e o rack deslizante para evitar queimaduras. Certifique-se de usar equipamento de proteção individual adequado, como luvas e jaleco.
   2. Com a garra, transfira imediatamente o suporte de corrediça quente para um banho-maria destilado e lave-o por 2 min.
      nota: Certifique-se de que as amostras não esfriem no TTR1x.
   3. Lave as lâminas em etanol 100% fresco por 2 min.
   4. Deixe as lâminas secarem em temperatura ambiente por 2 min.
3. Criação de barreiras
   1. Com uma caneta de barreira hidrofóbica (consulte a Tabela de Materiais), desenhe uma barreira ao redor da amostra. Deixe secar por pelo menos 5 min.
      nota: Deixe a barreira realmente secar. Se ele se desgastar durante o procedimento, não hesite em desenhá-lo novamente. Evite tocar no tecido com a caneta. O protocolo pode ser pausado durante a noite aqui.
4. Digestão de protease
   1. Coloque as lâminas no suporte de lâminas e adicione ~ 4 gotas de Protease Plus por amostra (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Cubra a bandeja de controle de umidade com uma tampa e insira-a no forno de hibridização por 30 min a 40 °C.
      nota: Para evitar a evaporação, certifique-se de que o botão giratório esteja completamente girado para a posição travada.
   3. Retire a bandeja do forno e remova a grade deslizante.
   4. Uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina em um suporte de lâminas submerso em uma mancha cheia de água destilada.
   5. Lave as lâminas 2x por 2 min em água destilada em temperatura ambiente. Agite constantemente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Forno HybEZ (110v)	Diagnóstico Celular Avançado Inc.	Rolamento 321710
Rack de slides HybEZ	Diagnóstico Celular Avançado Inc.	300104
Caneta de barreira hidrofóbica ImmEdge	Diagnóstico Celular Avançado Inc.	310018
RNAscope H202 & Reagente Protease Plus	Diagnóstico Celular Avançado Inc.	Rolamento 322330	Peróxido de hidrogênio x2 e Protease Plus x 1
Reagentes de recuperação de alvos de RNAscope	Diagnóstico Celular Avançado Inc.	Rolamento 322000