Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Executando o ensaio
NOTA: Não deixe as seções secarem entre as etapas de incubação.
- Hibridização da sonda HPV
NOTA: Certifique-se de que as sondas estejam pré-aquecidas para dissolver qualquer precipitação antes do uso. Para esta etapa, em vez da sonda do HPV, a peptidil-prolil isomerase B (PPIB) para controle positivo ou a di-hidrodipicolinato redutase (DAPB) para controle negativo (consulte a Tabela de Materiais) também podem ser usadas.
- Toque e/ou mova os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os no rack de slides. Adicione ~ 4 gotas de sonda de HPV para cobrir inteiramente cada seção.
- Cubra a bandeja com uma tampa e coloque-a no forno por 2 h a 40 °C.
NOTA: Para evitar a evaporação, certifique-se de que o botão giratório esteja completamente girado para a posição travada.
- Retire a bandeja do forno e remova a grade deslizante.
- Uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina em um suporte de lâminas submerso em um prato de coloração cheio de 1x tampão de lavagem.
- Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem por 2 min em temperatura ambiente com agitação constante. Repita isso com um tampão de lavagem 1x fresco.
- Hibridização de AMP1, AMP2, AMP3 e AMP4
NOTA: Essas etapas incluem hibridização no forno de hibridização e AMP1–AMP4 do kit adquirido (consulte a Tabela de Materiais).
- Toque e/ou mova para remover qualquer excesso de líquido das lâminas e coloque-as no suporte de lâminas. Adicione ~ 4 gotas de AMP1 para cobrir inteiramente cada seção.
- Cubra a bandeja com uma tampa e coloque-a no forno por 30 min a 40 °C.
- Retire a bandeja do forno e remova a grade deslizante.
- Uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina em um suporte de lâminas submerso em um prato de coloração cheio de 1x tampão de lavagem.
- Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem por 2 min em temperatura ambiente com agitação constante. Repita isso com um tampão de lavagem 1x fresco.
- Repita as etapas 1.2.1–1.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP2 em vez de AMP1 e incube por 15 min a 40 ° C. Lave as lâminas 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresco.
- Repita as etapas 1.2.1–1.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP3 em vez de AMP1 e incube por 30 min a 40 ° C. Lave as lâminas 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresco.
- Repita as etapas 1.2.1–1.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP4 em vez de AMP1 e incube por 15 min a 40 ° C. Lave as lâminas 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresco.
- Hibridização de AMP5 e AMP6
NOTA: Essas etapas não incluem hibridização no forno, mas hibridização em temperatura ambiente. AMP5 e AMP6 vêm do kit adquirido (consulte a Tabela de Materiais).
- Toque e/ou mova os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os no rack de slides. Adicione ~ 4 gotas de AMP5 para cobrir inteiramente cada seção.
- Cubra a bandeja com uma tampa e incube por 30 min em temperatura ambiente.
- Uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque-o em um rack de lâminas submerso em um prato de coloração cheio de 1x tampão de lavagem.
- Lave as lâminas em 1x tampão de lavagem por 2 min em temperatura ambiente com agitação constante. Repita isso com um tampão de lavagem 1x fresco.
- Repita as etapas 1.3.1–1.3.4, mas use ~ 4 gotas de AMP6 em vez de AMP5 e incube por 15 min em temperatura ambiente. Lave as lâminas 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem recente.
