1. Preparação de reagentes de contracoloração
- Prepare 50% de hematoxilina.
- Em uma capela de exaustão, adicione 100 mL de hematoxilina I de Gill (consulte a Tabela de Materiais) a 100 mL de água destilada em uma placa de coloração.
nota: A solução de coloração de hematoxilina a 50% pode ser reutilizada por até 1 semana.
- Prepare 0,02% (p / v) de água de amônia (reagente azulado).
- Na hotte, adicionar 1,43 ml de hidróxido de amónio 1 N a 250 ml de água destilada num cilindro graduado ou noutro recipiente. Sele o cilindro com filme de parafina. Misture bem seu conteúdo por 3x–5x.
nota: Para a quantificação do ensaio, é fundamental usar hidróxido de amônio. Os reagentes podem ser preparados com antecedência. Certifique-se de que todos os recipientes permaneçam cobertos.
2. Detecção de sinal com 3,3'-diaminobenzidina
CUIDADO: A diaminobenzidina (DAB) é tóxica. Siga as precauções e diretrizes de segurança apropriadas ao descartar e manusear este produto químico.
- Misture volumes iguais de DAB-A e DAB-B (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de tamanho apropriado, dispensando o mesmo número de gotas de cada solução. Faça ~ 120 μL de substrato DAB por seção (~ 2 gotas de cada reagente / total de 4). Misture bem por 3x–5x.
- Retire cada lâmina, uma de cada vez, do suporte de lâminas e toque e/ou mova para remover o excesso de líquido antes de colocá-la no suporte de lâminas.
- Pipete ~ 120 μL de DAB em cada seção de tecido. Certifique-se de que as seções estejam cobertas e incube por 10 min em temperatura ambiente.
- Descarte o DAB restante de acordo com a regulamentação local e insira a corrediça em um rack deslizante submerso em um prato de coloração cheio de água da torneira.
3. Contra-coloração
- Mova o suporte deslizante para uma placa de coloração contendo 50% de solução de coloração de hematoxilina e deixe descansar por 30 s em temperatura ambiente. Observe que os slides ficarão roxos.
- Transfira imediatamente o suporte de lâminas de volta para um prato de coloração contendo água da torneira e lave as lâminas 3x–5x movendo o rack para cima e para baixo.
- Continue repetindo a etapa de lavagem com água fresca da torneira até que os slides estejam limpos enquanto as seções permanecem roxas.
- Substitua a água da torneira no prato de coloração por água com amônia a 0.02%. Mova o rack para cima e para baixo 2x a 3x. Observe que a seção de tecido deve ficar azul.
- Substitua a água com amônia por água da torneira. Lave as lâminas 3x a 5x.
4. Desidratação
- Mova o suporte deslizante para uma mancha contendo etanol a 70% na hotte e deixe-a descansar por 2 min com agitação ocasional.
- Mova o suporte deslizante para uma primeira mancha contendo 100% de etanol e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
- Mova o suporte deslizante para uma segunda mancha contendo 100% de etanol e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
- Mova o rack deslizante para uma placa de coloração contendo xileno e deixe descansar por 5 min com agitação ocasional.
5. Montagem de slides
- Retire as corrediças do suporte deslizante e coloque-as planas, com as seções voltadas para cima na hotte.
- Monte uma lâmina de cada vez, adicionando 1 gota de um meio de montagem à base de xileno a cada lâmina e colocando cuidadosamente uma lamínula de 24 mm x 50 mm sobre a seção. Evite prender bolhas de ar.
- Seque as lâminas ao ar por ≥5 min.
6. Avaliação da amostra
- Examine as seções de tecido sob um microscópio de campo claro padrão com ampliação de 20x a 40x.
