Colheita de DRG da Coluna de Rato: Um Procedimento para Extrair o Gânglio da Raiz Dorsal da Coluna de um Modelo de Rato

Neste artigo

Resumo

Fonte: Schmidt, L. B. et al. O modelo in vivo da membrana corioalantóide de pintinho para avaliar a invasão perineural no câncer de cabeça e pescoço. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos a extração do gânglio da raiz dorsal ou DRG de uma espinha de rato colhida para aplicações a jusante.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Colheita e Preparação de DRGs (tempo estimado: 2 h, dia 8)

NOTA: Experimentos com camundongos e ratos requerem aprovação do IACUC. Em alguns países, o uso de ovos de galinha também requer aprovação.

Obtenha ratos Sprague Dawley de seis a sete semanas de idade (~ 200 g de peso) para extrair DRGs.
nota: Um rato deve render ~ 40 DRGs cervicais e torácicos. O DRG de camundongo também se integra ao CAM; no entanto, as condições para esta espécie precisam ser otimizadas de forma independente.
Em um gabinete de fluxo laminar, colete DRGs das regiões cervical e torácica seguindo o protocolo para extração de DRG de camundongo publicado em outro lugar. Siga a Figura 1 para obter orientação sobre como coletar DRGs.
1. Eutanasiar o rato por punção cardíaca após a administração de cetamina / xilazina injetada por via intraperitoneal. Limpe a pele do rato com etanol a 70% e remova a espinha do rato usando uma tesoura. Não realize luxação cervical, pois isso danificaria os DRGs cervicais.
2. Separe as regiões cervical, torácica e lombar com a mesma tesoura, seguindo a representação anatômica esquemática e as imagens macroscópicas fornecidas na Figura 1A-D. Coloque as seções da lombada em uma placa de cultura de 10 cm com 1X PBS para manter os tecidos úmidos.
3. Com uma tesoura óssea delicada, abra os ossos vertebrais nas faces dorsal e ventral, separando a coluna em duas metades laterais (Figura 1E-F). Coloque as seções de tecido em um prato limpo de 10 cm com PBS 1X fresco.
4. Usando uma pinça, retire suavemente a medula espinhal dos ossos vertebrais para visualizar os DRGs (Figura 1G).
5. Com uma pinça fina embaixo de cada DRG, segure-a e puxe-a para fora da cavidade óssea em que está alojada. Não segure o DRG diretamente, pois isso causará danos aos tecidos. Não corte os feixes de axônios do DRG (Figura 1H).
  nota: Evite usar DRGs lombares, pois eles têm integração reduzida no CAM. Para a localização da região DRG, siga a ilustração esquemática e as imagens anatômicas macroscópicas na Figura 1A-D.
Imediatamente após a colheita, coloque cada DRG em meio de cultura DMEM suplementado com 2% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) e 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) para ajudar a prevenir a contaminação bacteriana dos DRGs. Agrupe todos os DRGs na mesma placa de cultura de 6 cm com 4 mL de meio de cultura.
Após a colheita de todos os DRGs, transfira-os para uma nova placa de cultura com meio de cultura DMEM suplementado com 2% de Pen/Strep mais 10% de FBS e contendo 1,25 μg/mL de corante fluorescente vermelho. Incubar durante 1 h na incubadora de cultura de células.

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Resultados

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Figura 1: Extração de DRG no dia 8. A. Esquema do rato ilustrando a localização anatômica da coluna vertebral. B. Diagrama da configuração das vértebras do rato mostrando diferentes regiões do corpo; verde para cervical, azul escuro para torácico, laranja para lombar e azul claro para vértebras sacrais. C-D. Aspecto ventral da coluna vert...