Membrana corioalantóide de pintinho ou modelo de tumor CAM: um método in ovo para simular a invasão perineural de células tumorais

Resumo

Fonte: Schmidt, L. B. et al. O modelo in vivo da membrana corioalantóide de pintinho para avaliar a invasão perineural no câncer de cabeça e pescoço. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, descrevemos o método de co-cultura de gânglios da raiz dorsal e células cancerígenas na membrana corioalantóide de pintinho ou CAM para estudar a invasão perineural.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Enxertia de DRG no CAM (tempo estimado: 40 min, dia 8)

1. Prepare uma placa de cultura de 6 cm com meio HBSS para lavar os DRGs antes do implante. Traga os ovos preparados para o gabinete de fluxo laminar de cultura de células. Remova a membrana de parafina do ovo (Figura 1A).
2. Com uma pinça fina e estéril, segure suavemente um DRG de dentro do meio de cultura. Mergulhe-o no meio HBSS para remover o excesso de meio que contém o corante fluorescente. Segure o DRG com muito cuidado; caso contrário, ele grudará na pinça.
3. Colocar o DRG no CAM, tomando cuidado para não perfurar a membrana (Figura 1B-C). Se necessário, use outro par de pinças para ajudar a separar o DRG da ponta da pinça ao colocá-lo no CAM.
   nota: Manter o DRG úmido com meio HBSS também facilitará o descolamento da pinça.
4. Cubra o ovo com um molho de filme transparente estéril. Cubra todas as janelas e perfurações feitas na casca do ovo para evitar contaminação bacteriana (Figura 1D).
5. Após enxertar os DRGs em todos os ovos, incubar os ovos em uma incubadora umidificadora a 38 °C e 54% de umidade por 2 dias, sem rotação.

2. Enxertia de células tumorais no CAM (tempo estimado: 1 h 30 min, dia 10)

1. 48 h antes de enxertar as células, coloque as células necessárias em placas de cultura. Calcule 0,5 a 1 x 10⁶ células por óvulo para células UM-SCC-1 para gerar tumores tridimensionais no CAM. Esteja ciente de que o número de células pode variar de acordo com a linha celular.
2. Aspire o meio e adicione o meio de cultura DMEM suplementado com 1% de caneta / estreptococo mais 10% de FBS e 2,5 μg / mL de corante fluorescente verde. Incubar durante 1 h a 37 °C na incubadora de cultura celular. Em seguida, verifique a intensidade da fluorescência no microscópio, aspire o meio, lave uma vez com 1X PBS e adicione 0,25% de tripsina por até 10 min. Neutralize a tripsina com meio suplementado com DMEM.
3. Centrifugue a 250 x g por 4 min para formar um pellet celular. Aspire o meio DMEM e ressuspenda em HBSS para lavar o excesso de corante fluorescente. Conte as células usando um hemocitômetro.
4. Traga os ovos para o gabinete de fluxo laminar de cultura de células. Com tesoura e pinça, abra o curativo de filme transparente que cobre o ovo (Figura 1E-F).
5. Centrifugue novamente o número calculado de células, aspire o meio HBSS e ressuspenda a uma concentração final de 0,5 a 1 x 10⁶ células por 5 μL do mesmo meio (Figura 1G). Preparar a quantidade necessária para o número total de ovos (5 μL de suspensão celular por ovo).
6. Coloque 5 μL de solução celular no CAM, a cerca de 2 mm do DRG (Figura 1H). Mantenha distâncias uniformes entre o DRG e as células. Tenha muito cuidado para não perturbar o ovo para minimizar a propagação das células.
   nota: Para iniciar a implantação celular, escolha ovos nos quais a superfície CAM esteja visualmente seca. Se a superfície estiver muito úmida, as células podem se espalhar e não formar tumores regulares.
7. Cubra o ovo com um novo molho de filme como na etapa 1.4. Enxertar as células em todos os óvulos. Incubar os ovos em uma incubadora umidificadora a 38 °C e 54% de umidade por 7 dias, sem rotação.

Resultados

Figura 1: Enxertia de DRG, células e coleta de CAM: No dia 8: A. CAM facilmente observada após a remoção da membrana de cera de parafina. B-C. Com uma pinça fina, o DRG é colocado no CAM. O ovo é coberto com molho de filme e colocado na incubadora; As setas apontam para as aberturas que estão cobertas. No dia 10: E-F. O c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora de ovos	Esportista Digital GQF	#1502	Incubadora de ovos equipada com controle de temperatura e umidade do termostato digital rotador automático
Cortador de gravação	DREMEL	#108	Usado para perfurar a casca do ovo
Pinça Graefe extra fina, curva	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	#11151-10	Usado para enxertar DRG no CAM no dia 8 e para colher tecido CAM no dia 17
Pinça Graefe extra fina, reta	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	#11150-10	Usado para enxertar DRG no CAM no dia 8 e para colher tecido CAM no dia 17
Ovos fertilizados de Lohmann White Leghorn			Ovos fertilizados nos primeiros dias de fertilização, de preferência no primeiro dia após a fertilização. Os ovos usados neste protocolo são da Michigan State University Poultry Farm.
Pinça de filtro	EMD Millipore	#XX6200006P	Pinça romba usada para remover a casca do ovo
HBSS (1x)	Gibco	#14025-092	Solução salina balanceada de Hank
Membrana de cera de parafina	Filme parafilme de laboratório	#PM-996	Usado para cobrir temporariamente as aberturas dos ovos até a enxertia de DRG no dia 8
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	#10010-023	Solução salina tamponada com fosfato
Curativo de filme transparente Tegaderm	3m	#9505W	Estéril, 6x7cm usado para cobrir as aberturas dos ovos durante a incubação