Modelagem do tratamento intratumoral com inibidores de miRNA: um método para analisar o efeito dos inibidores de miRNA no crescimento tumoral em modelo murino

Resumo

Fonte: Ramirez-Moya, J. et al. Inibição in vivo de microRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a entrega in vivo de inibidores de miRNA como agentes terapêuticos contra o crescimento tumoral em modelos ortotópicos de camundongos. A administração intratumoral de inibidores sintéticos de miRNA ou antagomiRs permite que eles se liguem e inibam miRNAs endógenos, causando assim a regulação positiva do mRNA e a supressão do crescimento tumoral.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Inoculação de células de flanco e tratamento intratumoral com antagomiR

1. Preparação celular
   1. Projete uma linha celular de câncer de tireoide humano Cal62 (mutações KRASG12R e p53A161D) para superexpressar uma construção transgênica que expressa constitutivamente GFP e luciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Selecione as células transgênicas por resistência a antibióticos ou classificando as células GFP-positivas com citometria de fluxo.
   2. Cultive as células no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com penicilina, estreptomicina e 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C e 5% de CO₂.
   3. Suspender 1 x 10⁶ células em 50 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C.
2. Inoculação celular nos flancos de camundongos
   1. Misture as células com a mesma quantidade de matriz de membrana basal. Por exemplo, adicione 1 x 10⁶ células em 50 μL de PBS a 50 μL de matriz de membrana basal (consulte a Tabela de Materiais) e misture delicadamente.
   2. Injete 100 μL da amostra (células em PBS + matriz de membrana basal) por via subcutânea no flanco esquerdo de camundongos BALB/c nu/nu imunodeficientes de 6 semanas de idade usando uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha 27G 1/2'' (0,4x13 mm).
3. Tratamento intratumoral com antagomiR
   1. Suspender o antagomiR (ver Tabela de Materiais) ou o controlo negativo em 500 μL de água destilada isenta de RNase.
   2. Antes da injeção, prepare 2 nmol do antagomiR ou do controle junto com um reagente de entrega in vivo (consulte a Tabela de Materiais) para cada injeção.
      1. Primeiro misture a solução de antagomiR (ver Tabela de Materiais) e o tampão de complexação (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1. Por exemplo, adicione 80 μL de solução inibidora de miRNA (16 nmol) a 80 μL de tampão de complexação (incluído no kit de reagentes de entrega in vivo, consulte a Tabela de Materiais).
      2. Leve o reagente de entrega in vivo à temperatura ambiente. Adicione 160 μL a um tubo de 1,5 mL e adicione imediatamente 160 μL de solução diluída de antagomiR. Retorne o reagente restante a -20 °C. Se necessário, conservar o reagente a 4 °C durante um período máximo de uma semana após a descongelação.
      3. Vórtice imediatamente (10 s) para garantir a complexação do reagente de entrega in vivo-antagomiR.
      4. Incubar a mistura de reagente-antagomiR de libertação in vivo durante 30 min a 50 °C. Centrifugar brevemente o tubo para recuperar a amostra.
      5. Dilua o complexo 6 vezes adicionando 1360 μL de PBS pH 7,4 e misture bem.
      6. Prossiga com a administração in vivo do complexo reagente-antagomiR (8 camundongos/condição) ou armazene o complexo a 4 °C por até uma semana antes da injeção. Injetar 200 μL por via intratumoral em cada tumor (2 nmol de antagomiR).
         NOTA: O volume e a quantidade do antagomiR são independentes do volume do tumor.
   3. Realize o tratamento 3 vezes por semana (segunda, quarta e sexta-feira) durante 2 semanas.
4. Análise do crescimento tumoral
   1. Injete 50 μL de uma solução de 40 mg / mL de substrato de D-luciferina (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea em cada ponto de tempo com uma seringa de 1 mL com uma agulha 27G 1/2 '' (0,4 mm x 13 mm).
      1. Aos 8 minutos após a injeção, anestesiar os camundongos usando isoflurano a 3% misturado com oxigênio. Avalie o nível de anestesia por reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé) e ajuste a administração do anestésico conforme apropriado para manter o plano cirúrgico.
      2. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a dessecação.
5. Imagem do sinal bioluminescente com software de imagem in vivo (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Os paquímetros também podem ser usados para medir o volume e o crescimento do tumor.
6. Uma vez obtidos os sinais de bioluminescência, analise o crescimento tumoral comparando os dois tratamentos e determine a significância usando um teste t. Para analisar a variância dentro do grupo, use o SEM.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz de Membrana Basal: Matriz de Membrana Basal Matrigel Alta Concentração	Corning	#354248
AntagomiR: inibidor de miRNA mirVana	Thermo Fisher	4464088	Pronto para in vivo
Reagente de entrega in vivo: Reagente Invivofectamine 3.0	Thermo Fisher	FIV 3005
Controle negativo: inibidor de miRNA mirVana, controle negativo #1	Thermo Fisher	4464077	Pronto para in vivo
XenoLight D-Luciferina - Substrato Bioluminescente de Sal K+	PerkinElmer	122799	Diluído em PBS
Software de imagem in vivo: IVISLumina II Imaging System	Caliper Ciências da Vida