Incorporação de esferoides 3D em gotas de gel de agarose: uma técnica para preservar esferoides para análise a jusante

Resumo

Fonte: Rolver, M. G. et al. Avaliando a viabilidade e morte celular em culturas esferóides 3D de células cancerígenas. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve a técnica para incorporar esferoides 3D em gotas de gel de agarose para preservação. Os esferoides 3D incorporados podem ser usados posteriormente para análise a jusante.

Protocolo

1. Incorporação de esferoides 3D

1. Prepare o gel de agarose no qual os esferóides são incorporados (necessário apenas na primeira vez que executar o protocolo)
   1. Misture 1 g de bacto-ágar em 50 mL de ddH₂O.
   2. Aqueça lentamente no forno de micro-ondas até que o bacto-ágar se dissolva e um gel homogêneo se forme. Não deixe o gel ferver.
   3. Manter o bacto-ágar quente em banho-maria a 60 °C.
   4. Conservar a 4 °C entre as experiências.
2. Incorporação de esferoides
   1. No dia 1, para cada condição, agrupe um mínimo de 12 esferoides em um tubo de 1,5 mL.
   2. Lave uma vez com 1 mL de PBS 1X gelado.
   3. Para fixar os esferoides, adicionar 1 mL de paraformaldeído a 4%.
      nota: O manuseio do paraformaldeído deve ser realizado em uma capela de exaustão.
   4. Deixe-os incubar por 24 h em RT.
   5. No dia 2, aqueça o gel de agarose com cuidado, colocando-o em um copo cheio de água em um forno de micro-ondas. Certifique-se de que o gel não ferva. Mantenha aquecido em uma placa de aquecimento de bancada, a 60 °C até o uso.
   6. Lave os esferóides duas vezes com 1 mL de PBS 1X gelado.
   7. Aspire a maior parte do PBS 1X (deixar aproximadamente 100 μL neste ponto é prático para manusear os esferoides).
   8. Prepare uma pipeta de 20 μL cortando a ponta da pipeta em uma inclinação para obter uma ponta mais pontiaguda com um orifício maior (Figura 1).
      NOTA: A próxima parte deve ser feita rapidamente para garantir a transferência ideal do esferóide e evitar a solidificação da gota de gel. Se nenhum bloco de aquecimento estiver disponível, recomenda-se primeiro pegar os esferóides e depois fazer a acarose cair (ou seja, mudando a ordem dos pontos 1.2.9 e 1.2.10).
   9. Faça uma gota de gel de agarose em uma lâmina de microscópio. Coloque a lâmina em um bloco de aquecimento quente para evitar que a agarose solidifique.
   10. Usando a ponta da pipeta modificada (etapa 1.2.8), pegue o maior número possível de esferoides em um volume de 15 a 20 μL.
   11. Injete cuidadosamente o 1X PBS contendo esferóide de 15 a 20 μL no centro da gota de gel de agarose sem tocar na lâmina do microscópio.
       nota: Este é um ponto um pouco difícil. Os esferoides serão perdidos se a ponta da pipeta tocar a lâmina do microscópio ao injetar os esferoides na gota de gel. É aconselhável praticar todo o processo de fazer a gota de agarose e injetar os esferóides injetando um líquido colorido na gota. Isso permitirá a visualização de uma penetração potencial através da gota, pois o líquido colorido vazará para a lâmina.
   12. Deixe o gel de agarose endurecer incubando por 5 a 10 minutos em RT ou a 4 ° C. Uma vez que a gota de gel tenha solidificado um pouco (mas ainda seja bastante macia), empurre cuidadosamente a gota de gel da lâmina do microscópio em um de tecido plástico com um bisturi.
   13. Cubra os de tecido plástico em etanol 70%.
       nota: Neste ponto, os esferóides podem ser usados diretamente ou armazenados por meses.
   14. Incorpore o esferóide embebido em agarose em parafina, corte em lâminas de camada de 2 a 3 μm de espessura e cove com hematoxilina e eosina ou submeta a coloração imuno-histológica.

Resultados

Figura 1: Fixação, incorporação e análise imuno-histoquímica de esferoides. (A) Representação esquemática do protocolo de incorporação de esferoides. As etapas individuais são marcadas como (i-vii). (B) Imagem do esferóide MDA-MB-231 incorporado. Barra de escala: 50 μm. (C) Imagem representativa do esferóide MDA-MB-231 tratado com quimioterapia submetido à análise IHC com anticorpos contra p-53. As linhas tracejadas mostram a circunferência do esferóide. Barra de escala = 20 μm. (D, E) Imagens representativas de esferoides MDA-MB-231 tratados com DMSO ou quimioterapia (painéis superior e inferior, respectivamente). As células MDA-MB-231 foram semeadas em placas de 96 poços de fixação ultrabaixa, cultivadas por 7 dias e tratadas com quimioterapia nos dias 2 e 4. No dia 7, os esferoides foram incorporados seguidos de análise por IHQ com anticorpos primários contra Ki-67 (D) e p53 (E). As caixas brancas representam imagens com zoom. Barra de escala = 20 μm em ambas as ampliações (n=3).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bacharelado	BD Biociência	#214010	Usado para preparação de gel de agarose
Formaldeído	Produtos químicos da VWR	#9713.1000	Usado para fixação celular
Medim Uni-safe	Medim Histotechnologie	Telefone: 10-0114	Usado para armazenamento de esferóides embutidos
Corrediça de adesão Superfrost Ultra-Plus	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Lâmina de vidro do microscópio usada para encaixar
CellTiter-Glo Ensaio de viabilidade de células 3D	Promega	#G9681	Usado para o ensaio de viabilidade celular