Incorporação de esferoides 3D em gotas de gel de agarose: uma técnica para preservar esferoides para análise a jusante

Neste artigo

Resumo

Fonte: Rolver, M. G. et al. Avaliando a viabilidade e morte celular em culturas esferóides 3D de células cancerígenas. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve a técnica para incorporar esferoides 3D em gotas de gel de agarose para preservação. Os esferoides 3D incorporados podem ser usados posteriormente para análise a jusante.

Protocolo

1. Incorporação de esferoides 3D

Prepare o gel de agarose no qual os esferóides são incorporados (necessário apenas na primeira vez que executar o protocolo)
1. Misture 1 g de bacto-ágar em 50 mL de ddH₂O.
2. Aqueça lentamente no forno de micro-ondas até que o bacto-ágar se dissolva e um gel homogêneo se forme. Não deixe o gel ferver.
3. Manter o bacto-ágar quente em banho-maria a 60 °C.
4. Conservar a 4 °C entre as experiências.
Incorporação de esferoides
1. No dia 1, para cada condição, agrupe um mínimo de 12 esferoides em um tubo de 1,5 mL.
2. Lave uma vez com 1 mL de PBS 1X gelado.
3. Para fixar os esferoides, adicionar 1 mL de paraformaldeído a 4%.
  nota: O manuseio do paraformaldeído deve ser realizado em uma capela de exaustão.
4. Deixe-os incubar por 24 h em RT.
5. No dia 2, aqueça o gel de agarose com cuidado, colocando-o em um copo cheio de água em um forno de micro-ondas. Certifique-se de que o gel não ferva. Mantenha aquecido em uma placa de aquecimento de bancada, a 60 °C até o uso.
6. Lave os esferóides duas vezes com 1 mL de PBS 1X gelado.
7. Aspire a maior parte do PBS 1X (deixar aproximadamente 100 μL neste ponto é prático para manusear os esferoides).
8. Prepare uma pipeta de 20 μL cortando a ponta da pipeta em uma inclinação para obter uma ponta mais pontiaguda com um orifício maior (Figura 1).
  NOTA: A próxima parte deve ser feita rapidamente para garantir a transferência ideal do esferóide e evitar a solidificação da gota de gel. Se nenhum bloco de aquecimento estiver disponível, recomenda-se primeiro pegar os esferóides e depois fazer a acarose cair (ou seja, mudando a ordem dos pontos 1.2.9 e 1.2.10).
9. Faça uma gota de gel de agarose em uma lâmina de microscópio. Coloque a lâmina em um bloco de aquecimento quente para evitar que a agarose solidifique.
10. Usando a ponta da pipeta modificada (etapa 1.2.8), pegue o maior número possível de esferoides em um volume de 15 a 20 μL.
11. Injete cuidadosamente o 1X PBS contendo esferóide de 15 a 20 μL no centro da gota de gel de agarose sem tocar na lâmina do microscópio.
  nota: Este é um ponto um pouco difícil. Os esferoides serão perdidos se a ponta da pipeta tocar a lâmina do microscópio ao injetar os esferoides na gota de gel. É aconselhável praticar todo o processo de fazer a gota de agarose e injetar os esferóides injetando um líquido colorido na gota. Isso permitirá a visualização de uma penetração potencial através da gota, pois o líquido colorido vazará para a lâmina.
12. Deixe o gel de agarose endurecer incubando por 5 a 10 minutos em RT ou a 4 ° C. Uma vez que a gota de gel tenha solidificado um pouco (mas ainda seja bastante macia), empurre cuidadosamente a gota de gel da lâmina do microscópio em um de tecido plástico com um bisturi.
13. Cubra os de tecido plástico em etanol 70%.
  nota: Neste ponto, os esferóides podem ser usados diretamente ou armazenados por meses.
14. Incorpore o esferóide embebido em agarose em parafina, corte em lâminas de camada de 2 a 3 μm de espessura e cove com hematoxilina e eosina ou submeta a coloração imuno-histológica.

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Resultados

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Figura 1: Fixação, incorporação e análise imuno-histoquímica de esferoides. (A) Representação esquemática do protocolo de incorporação de esferoides. As etapas individuais são marcadas como (i-vii). (B) Imagem do esferóide MDA-MB-231 incorporado. Barra de escala: 50 μm. (C) Imagem representativa do esferóide MDA-MB-231 tr...