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Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Preparação da Matriz Extracelular da Língua (TEM)
- Execute camundongos por luxação cervical e remova as línguas usando tesouras cirúrgicas estéreis e pinças.
- Mergulhe as línguas em etanol a 75% por 3 min e, em seguida, coloque cada língua em um tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL com 1 mL de solução tamponada com fosfato estéril (PBS) a 10 mM.
nota: A concentração de PBS em todas as etapas seguintes é a mesma que a concentração nesta etapa.
- Lise celular por congelamento-descongelamento: Congelar as línguas em tubos EP a -80 °C durante 1 h e depois descongelar as línguas à temperatura ambiente durante 45 min durante 3 ciclos.
- Carregue cada língua em um pedaço de sutura cirúrgica usando uma agulha cirúrgica e enrole a extremidade da sutura com um pequeno pedaço de papel alumínio estéril. Realizar a operação em uma placa de cultura de 3,5 cm ou 6 cm contendo etanol a 75% em condições estéreis.
nota: O comprimento apropriado de cada peça de sutura cirúrgica é de cerca de 20 cm, e o tamanho apropriado de cada pedaço de papel alumínio é de cerca de 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). A língua deve ser carregada perto do papel alumínio.
- Enxágue cada língua com 3 mL de PBS estéril em uma placa de cultura de 3,5 cm ou 6 cm por 30 s. Execute esta operação em condições estéreis.
- Lave as línguas com água ultrapura: Adicione ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de água ultrapura estéril até uma concentração final de 90 μg / mL. Coloque as línguas na garrafa que contém uma barra de mistura. Aperte a tampa do frasco com parte da sutura permanecendo fora do frasco. Execute esta operação em condições estéreis.
nota: Até 5 línguas podem ser colocadas no mesmo frasco em consideração ao entrelaçamento da sutura. O papel alumínio está no final da sutura na garrafa para evitar que a língua escorregue. As línguas devem ser colocadas a 2 cm de altura do fundo do frasco, ajustando o comprimento da sutura restante dentro do frasco. Esta observação também é para as etapas 1.8, 1.10, 1.12 e 1.16.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético por 12 h.
- Lave as línguas com NaCl: Adicione ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de NaCl 1 M estéril até uma concentração final de 90 μg / mL. Mova as línguas e a barra de agitação para dentro da garrafa. Aperte a tampa do frasco com parte da sutura permanecendo fora do frasco. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético por 24 h.
- Lise celular por Triton X-100: Adicione ampicilina a uma concentração final de 90 μg / mL em um frasco de boca larga com 250 mL de Triton X-100 estéril a 2% em PBS. Mova as línguas e a barra de agitação para dentro da garrafa. Aperte a tampa do frasco com parte da sutura permanecendo fora do frasco. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético por 48 h.
- Lave as línguas com CaCl2 / MgCl2: Adicione ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de 5 mM de CaCl2 / MgCl2 estéril até uma concentração final de 90 μg / mL. Mova as línguas e a barra de agitação para dentro da garrafa. Aperte a tampa do frasco com parte da sutura permanecendo fora do frasco. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético por 24 h.
- Digestão por DNase: Adicione 1 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) a cada tubo EP. Adicionar DNase em HBSS, respectivamente, até uma concentração final de 300 μM. Mover cada língua para cada tubo EP, com parte da sutura fora do tubo. Execute esta operação em condições estéreis.
nota: Certifique-se de que a parte da sutura que permanece dentro das garrafas nas etapas anteriores também permaneça dentro do tubo EP nesta etapa, e certifique-se de que a parte da sutura que permanece fora das garrafas nas etapas anteriores também permaneça fora do tubo EP nesta etapa.
- Incubar as línguas em tubos EP a 37 °C durante 24 h.
- Lave as línguas com PBS: Adicione ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de PBS estéril até uma concentração final de 90 μg / mL. Mova as línguas e a barra de agitação para dentro da garrafa. Aperte a tampa do frasco com parte da sutura permanecendo fora do frasco. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético por 24 h.
- Conservar o TEM preparado em PBS estéril a 4 °C até à utilização.