Criomoagem de tecido descelularizado: uma técnica para obter pó fino de matriz extracelular

Resumo

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabricação de espumas e microtransportadores derivados de matriz extracelular como cultura de células específicas de tecido e plataformas de entrega. J. Vis. Exp. (2017)

Neste vídeo, apresentamos o protocolo para obter pó de matriz extracelular finamente moído a partir de tecido descelularizado liofilizado por criomoagem. O ECM em pó mantém sua composição bioquímica e pode ser usado para síntese de microcarreadores.

Protocolo

1. Processamento de Tecidos Descelularizados

1. Descelularização e liofilização
   1. Descelularizar o(s) tecido(s) de interesse seguindo um protocolo estabelecido.
      nota: Os andaimes no estudo atual foram preparados seguindo os protocolos de descelularização publicados para DAT humano, DDT suíno e DLV suíno. O colágeno insolúvel disponível comercialmente também pode ser usado para fabricar espumas e microtransportadores, como o colágeno proveniente do tendão bovino, que tem sido usado com sucesso em uma faixa de concentração de 10 a 50 mg / mL. Outras fontes de colágeno insolúvel podem ser utilizadas, mas podem exigir otimização para identificar a faixa de concentração que produzirá andaimes estáveis.
   2. Transfira o tecido descelularizado hidratado ou o colágeno purificado para um tubo de centrífuga de 50 mL com pinça e adicione água bidestilada (ddH₂O) suficiente para submergir o tecido, até um volume total máximo de 35 mL.
   3. Congele a amostra durante a noite a -80 °C, com o tubo de centrífuga posicionado horizontalmente durante o congelamento para maximizar a área de superfície para sublimação durante a liofilização subsequente.
   4. Remova a tampa do tubo de centrífuga e transfira a amostra congelada para um frasco de liofilização.
   5. Liofilize a amostra usando um liofilizador de laboratório por 48 a 72 h ou até que esteja totalmente seca.
      nota: O tempo de secagem pode variar para diferentes liofilizadores e tecidos descelularizados.
   6. Pique finamente a ECM liofilizada em pedaços pequenos (~ 1–2 mm³) usando uma tesoura cirúrgica afiada.
   7. Armazene o ECM picado em um dessecador até que esteja pronto para processamento posterior.
      nota: Recomenda-se que o ECM picado seja usado imediatamente para evitar a absorção de umidade do ambiente.
2. Criofresagem (opcional para fabricação de espuma)
   1. Encha uma câmara de fresagem de aço inoxidável de 25 mL para um sistema de moinho de bolas de laboratório com ECM liofilizado picado e adicione duas esferas de fresagem de aço inoxidável de 10 mm.
   2. Feche e mergulhe completamente a câmara de moagem carregada em nitrogênio líquido por 3 min.
   3. Triture a amostra congelada por 3 min a 30 Hz (1.800 rpm).
   4. Repita as etapas 1.2.2 e 1.2.3 até que o ECM seja fresado em um pó fino.
      nota: O número de vezes que essas etapas devem ser repetidas pode variar entre as fontes de ECM. Por exemplo, o DAT normalmente requer 3 ciclos de moagem para gerar um pó fino.
   5. Transfira o pó usando uma colótula para um frasco de vidro, feche bem e armazene em um dessecador.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cabos de garra jacaré	VWR	Rolamento 470149-728
papel-alumínio	Fisher Científico	01-213-101
Balança analítica	Sartorius	CPA225D
Sistema de criomoagem	Retsch	20.745.0001	MM 400
Dessecador	Fisher Científico	8624426	Para armazenamento liofilizado de ECM e bioscaffold
Frasco Dewar	Fisher Científico	10-196-6	Forma baixa; faixa de volume de 250 a 500 mL
Água bidestilada (ddH2O)			Do Sistema de Purificação de Água Barnstead GenPure xCAD
ECM (Matriz Extracelular)			Isolado do tecido adiposo humano, derme suína ou miocárdio suíno, conforme descrito em Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010
fórceps	VWR	Rolamento 37-501-32	Para transferir as espumas
Congelador (-20 °C)	VWR	Rolamento 97043-346
Congelador ( -80 °C)	Thermo Científico	EXF40086A
Frascos de vidro	Fisher Científico	03-339-26D	Para armazenar ECM criomolado liofilizado
Nitrogênio líquido			Para eletropulverização
Liofilizador	Labconco	7750021	Zona Livre4.5
Câmara de fresagem	Retsch	02.462.0213	Volume de 25 mL recomendado
Esferas de fresagem	VWR	16003-606	10 mm de diâmetro, aço inoxidável recomendado
Penicilina-estreptomicina	Tecnologias da Vida	15140-122	Usado para meios de proliferação
EXP de Pipeta-Auxílio	Mandel Científico	DRU-4-000-101
Escópula	VWR	89259-968	Para coleta de microtransportadores
Tesoura cirúrgica	VWR	82027-590