Preparação de suspensão de ECM: uma técnica para obter suspensão homogênea de matriz extracelular derivada de tecido

Resumo

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabricação de espumas e microtransportadores derivados de matriz extracelular como plataformas de cultura e entrega de células específicas de tecido. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo descreve a preparação de uma suspensão de matriz extracelular homogeneizada e digerida a partir de tecidos descelularizados e liofilizados. Essa técnica ajuda na fabricação de espumas porosas derivadas de ECM e microtransportadores para uso como substratos em modelos avançados de cultura de células 3D.

Protocolo

1. Processamento de Tecidos Descelularizados

1. Descelularização e liofilização
   1. Descelularizar o(s) tecido(s) de interesse seguindo um protocolo estabelecido.
      nota: Os andaimes no presente estudo foram preparados seguindo os protocolos de descelularização publicados para tecido adiposo descelularizado humano (DAT), tecido dérmico descelularizado suíno (DDT) e ventrículo esquerdo descelularizado suíno (DLV). O colágeno insolúvel disponível comercialmente também pode ser usado para fabricar espumas e microtransportadores, como o colágeno proveniente do tendão bovino, que tem sido usado com sucesso em uma faixa de concentração de 10 a 50 mg / mL. Outras fontes de colágeno insolúvel podem ser utilizadas, mas podem exigir otimização para identificar a faixa de concentração que produzirá andaimes estáveis.
   2. Transferir o tecido descelularizado hidratado ou o colágeno purificado para um tubo centrífugo de 50 mL com pinça e adicionar água bidestilada suficiente (ddH₂O) para submergir o tecido, até um volume total máximo de 35 mL.
   3. Congele a amostra durante a noite a -80 °C, com o tubo de centrífuga posicionado horizontalmente durante o congelamento para maximizar a área de superfície para sublimação durante a liofilização subsequente.
   4. Remova a tampa do tubo de centrífuga e transfira a amostra congelada para um frasco de liofilização.
   5. Liofilize a amostra usando um liofilizador de laboratório por 48 a 72 h ou até que esteja totalmente seca.
      nota: O tempo de secagem pode variar para diferentes liofilizadores e tecidos descelularizados.
   6. Pique finamente a ECM liofilizada em pedaços pequenos (~ 1–2 mm³) usando uma tesoura cirúrgica afiada.
   7. Armazene o ECM picado em um dessecador até que esteja pronto para processamento posterior.
      nota: Recomenda-se que o ECM picado seja usado imediatamente para evitar a absorção de umidade do ambiente.
2. Criomoagem
   1. Encha uma câmara de fresagem de aço inoxidável de 25 mL para um sistema de moinho de bolas de laboratório com ECM liofilizado picado e adicione duas esferas de fresagem de aço inoxidável de 10 mm.
   2. Feche e mergulhe completamente a câmara de moagem carregada em nitrogênio líquido por 3 min.
   3. Moa a amostra congelada por 3 min a 30 Hz (1.800 rpm) em um pó fino.
      nota: O número de vezes que essas etapas devem ser repetidas pode variar entre as fontes de ECM. Por exemplo, o DAT normalmente requer 3 ciclos de moagem para gerar um pó fino.
3. Preparação da suspensão ECM
   1. Pesar 250 mg de ECM picado (para espumas) ou criomoído (para espumas ou microtransportadores) e transferi-lo para um tubo de centrífuga de 15 ml. Consulte a etapa 1.1.6 e a seção 1.2 para a preparação de ECM picada e ECM criomoída, respectivamente.
      nota: Este protocolo foi projetado para preparar uma suspensão de ECM de 50 mg/mL, que é recomendada para DAT humano, DDT suíno e DLV suíno. Dependendo da fonte específica de ECM, suspensões uniformes podem ser geradas em concentrações iniciais mais altas ou mais baixas.
   2. Adicione 5 mL de tampão 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) ao tubo da centrífuga e marque o nível do líquido no tubo.
   3. Prepare uma solução estoque de α-amilase adicionando 7,5 mg de α-amilase a 1 mL de tampão 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4). Adicione 100 μL da solução-mãe de α-amilase (0,75 mg de α-amilase: 0,3% p / p de tecido seco) à amostra. Adicionar 0,22 M NaH₂PO₄ para obter um volume final de 10 mL.
   4. Agite a suspensão continuamente a 300 rpm por 72 h à temperatura ambiente.
   5. Centrifugar a suspensão a 1.500 x g durante 10 min. Recolher e eliminar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento de ECM digerido. Ressuspenda o material peletizado em 10 mL de NaCl a 5% diluído em ddH₂O.
   6. Repita a etapa 1.3.5 para um total de dois enxágues com 5% de NaCl em ddH₂O.
   7. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o material peletizado em 10 ml de ddH₂O.
   8. Agite a suspensão continuamente a 300 rpm por 10 min em RT.
   9. Centrifugar a suspensão a 1.500 x g durante 10 min. Recolher e eliminar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento de ECM digerido.
   10. Adicione ácido acético 0,2 M à marca de 5 mL feita na etapa 1.3.2.
   11. Agitar a suspensão continuamente a 120 rpm O/N a 37 °C.
   12. Homogeneizar a suspensão ECM à temperatura ambiente em intervalos de 10 segundos usando um homogeneizador portátil equipado com uma sonda dente de serra de 10 mm de largura até que não restem fragmentos visíveis. Coloque a suspensão em um copo de água fria entre os intervalos de homogeneização para evitar superaquecimento.
       nota: Dependendo da fonte de MEC, pode ser necessária uma diluição adicional em ácido acético 0,2 M para obter uma suspensão homogênea. O resfriamento excessivo da suspensão ECM pode resultar em um aumento na viscosidade que pode interferir na homogeneização eficiente. Se for observado um aumento na viscosidade, a amostra pode ser reaquecida a 37 °C e submetida a processamento adicional.
   13. Conservar a 4 °C até um mês antes do fabrico da espuma ou do microtransportador.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido acético glacial	BioLoja	ACE222.5
α-amilase	sigma	101074694	de Aspergillus aryzae
Centrífuga 75004251	Thermo Científico		Com rotor de balde oscilante para tubos de centrífuga de 15 & 50 mL
Tubos de centrífuga (15 mL)	Sarstedt	Nº 62.554.205
Dessecador	Fisher Científico	8624426	Para armazenamento liofilizado de ECM e bioscaffold
Água bidestilada (ddH2O)			Do Sistema de Purificação de Água Barnstead GenPure xCAD
ECM (Matriz Extracelular)			Isolado de tecido adiposo humano, derme suína ou miocárdio suíno, conforme descrito em Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Homogeneizador portátil de mão	Fisher Científico	Telefone: 14-359-251	Velocidade: 8.000 - 30.000 rpm
Acessórios do homogeneizador: sondas geradoras de fundo de dente de serra	Fisher Científico	14-261-17	10 x 95 milímetros
Nitrogênio líquido
cloreto de sódio	BioLoja	7647-14-5
Fosfato de sódio monobásico	BioLoja	10049-21-5
Tesoura cirúrgica	VWR	82027-590