Fabricação de espuma derivada de matriz extracelular via liofilização: um procedimento para gerar andaimes biológicos a partir de ECM de tecidos descelularizados

Resumo

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabricação de espumas e microtransportadores derivados de matriz extracelular como plataformas de cultura e entrega de células específicas de tecidos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo descreve o método para sintetizar espumas puras derivadas de ECM sem a necessidade de reticulação química. Essas espumas derivadas de ECM encontram aplicações como modelos avançados de cultura de células 3D in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos.

Protocolo

1. Fabricação de espuma derivada de ECM

1. Preparar a suspensão homogénea de ECM dispersando o pó fino de ECM em solução tampão e incubar a 37 °C com agitação contínua a 120 rpm até aquecer a suspensão.
2. Diluir a suspensão de ECM em ácido acético 0,2 M até a concentração desejada.
   nota: Dependendo da fonte de ECM, espumas estáveis podem ser preparadas na faixa de 10 a 100 mg/mL, com 15 a 50 mg/mL como a faixa recomendada para DAT, DDT e DLV. Normalmente, as espumas fabricadas em concentrações mais altas serão um pouco menos porosas, mas mais estáveis em cultura e mais fáceis de manusear.
3. Usando uma seringa de 3 mL com uma agulha 18G para evitar a formação de bolhas na suspensão ECM, preencha o molde desejado com a suspensão ECM. Para fabricar as espumas DAT, DDT e DLV, dispense 400 μL de suspensão de ECM de 35 mg/mL em uma placa tratada com cultura de células de 48 poços.
   nota: A forma do molde selecionado e o volume da suspensão ECM determinarão a geometria da espuma resultante.
4. Cubra e congele os moldes durante a noite, colocando-os em um freezer de -20 °C ou -80 °C.
   nota: A temperatura de congelamento pode afetar a porosidade das espumas. Poros maiores são esperados quando as amostras são congeladas a -20 °C em comparação com -80 °C devido à formação de cristais de gelo maiores. Para fabricar espumas com uma estrutura porosa uniforme, certifique-se de que o molde não esteja em contato com uma superfície condutora para evitar o resfriamento direcional.
5. Coloque os moldes contendo as amostras congeladas em um frasco liofilizador. Conecte o frasco liofilizador ao sistema de liofilizador de laboratório e seque por 24 h.
   NOTA: É importante que a amostra permaneça congelada antes da liofilização.
6. Armazene as espumas liofilizadas em um dessecador até que sejam necessárias.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Balança analítica	Sartorius	CPA225D
Tubos de centrífuga (15 mL)	Sarstedt	Nº 62.554.205
Tubos de centrífuga (50 mL)	Sarstedt	Nº 62.547.205
Colágeno de Aquiles bovino tendão (insolúvel)	sigma	C9879	Ou colágeno insolúvel semelhante fonte; Pode ser usado como um alternativa ao descelularizado tecidos para confeccionar as espumas e microportadores
Dessecador	Fisher Científico	8624426	Para ECM liofilizado e Armazenamento de bioscaffold
Frasco Dewar	Fisher Científico	10-196-6	Forma baixa; faixa de volume de 250 a 500 mL
Água bidestilada (ddH_{2} O)			Fonte: Barnstead GenPure xCAD Sistema de purificação de água
D-PBS (tamponada com fosfato Solução salina)	bisonte europeu	311425125
ECM (Matriz Extracelular)			Isolado de tecido adiposo humano tecido, derme suína ou suíno miocárdio, conforme descrito em Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
fórceps	VWR	Rolamento 37-501-32	Para transferir as espumas
Congelador (-20 °C)	VWR	Rolamento 97043-346
Congelador ( -80 °C)	Thermo Científico	EXF40086A
Frascos de vidro	Fisher Científico	03-339-26D	Para armazenar liofilizado criomoizado Ecm
Nitrogênio líquido			Para eletropulverização
Liofilizador	Labconco	7750021	Zona Livre4.5
Agulha 18 G	VWR	C ABD305185	Para dispensar suspensão ECM em moldes
Agitador de incubadora orbital	SciLogex	832010089999	Temperatura controlada (37 °C)
Pipetas sorológicas (10 mL)	Sarstedt	Nº 86.1254.001
Pipetas sorológicas (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
cloreto de sódio	BioLoja	7647-14-5
Fosfato de sódio monobásico	BioLoja	10049-21-5