Fabricação de Bioscaffold por Eletropulverização: Uma Técnica para Gerar Scaffolds Microcarreadores Derivados de Matriz Extracelular de Tecido Descelularizado

Resumo

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabricação de espumas e microtransportadores derivados de matriz extracelular como plataformas de cultura e entrega de células específicas de tecido. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o procedimento de fabricação de microtransportadores derivados de matriz extracelular por eletropulverização. Esses microtransportadores simulam o microambiente específico do tecido nativo e são estáveis em modelos de cultura de células in vitro 3D de longo prazo.

Protocolo

1. Fabricação de microportadores derivados de ECM via eletropulverização

NOTA: Uma visão geral da configuração de eletropulverização é mostrada na Figura 1.

1. Incubar uma suspensão ECM criomonada previamente preparada a 37 °C com agitação contínua a 100 rpm O/N.
   nota: O ECM criomoído é usado para fabricar os microtransportadores derivados do ECM para garantir maior uniformidade na suspensão e evitar entupimentos durante a eletropulverização.
2. Carregue 3 mL de suspensão ECM em uma seringa Luer-Lock de 3 mL e conecte um conjunto de infusão alado no orifício da seringa.
   nota: Uma variedade de medidores de agulha pode ser usada, reconhecendo que a seleção pode influenciar o tamanho e a forma dos microtransportadores resultantes. Para fabricar os microportadores DAT, DDT e DLV, use uma agulha 25G.
3. Fixe a seringa dentro da bomba de seringa. Prenda a agulha a um suporte de retorta e posicione a ponta da agulha verticalmente a uma distância de 4 a 6 cm do topo de um frasco Dewar de formato baixo (faixa de tamanho de 250 a 500 mL recomendada).
4. Conecte um eletrodo de clipe jacaré à ponta da agulha e conecte-o ao terminal positivo do alto volumetage fonte de alimentação.
5. Dobre uma tira de papel alumínio (12 x 5 cm) sobre a borda do balão de vácuo.
6. Conecte um segundo eletrodo de clipe jacaré à borda externa da folha e conecte-o ao terminal da fonte de aterramento da fonte de alimentação.
7. Encha o balão Dewar com nitrogênio líquido a cerca de 1 cm do topo, de modo que 3/4 do papel alumínio fique submerso.
   nota: É importante manter o frasco Dewar cheio de nitrogênio líquido. A superfície do azoto líquido não deve estar a menos de 2 cm do topo do balão durante o processo de electropulverização. O reabastecimento contínuo do nitrogênio líquido é necessário para manter um nível constante durante a eletropulverização.
8. Ajuste a bomba da seringa para uma taxa de infusão de 30 mL / h.
   nota: Variar a taxa de infusão pode alterar a forma e o diâmetro do microtransportador, mas a faixa recomendada é de 25 a 35 mL / h. Embora seja altamente dependente da viscosidade da suspensão, taxas de fluxo abaixo de 25 mL/h podem resultar na geração de microtransportadores maiores. Em taxas de fluxo muito baixas, o tamanho e a forma dos microtransportadores podem se tornar menos homogêneos. Em taxas de infusão acima de 35 mL/h, a uniformidade das gotículas geradas por eletropulverização pode ser interrompida, resultando em microcarreadores não esféricos com uma distribuição de tamanho mais ampla.
9. Aplique uma tensão de 20 kV e ligue a bomba da seringa para iniciar a eletropulverização.
   nota: A voltagem pode ser variada para ajustar o tamanho dos microtransportadores e tende a ter um impacto maior no diâmetro do que a taxa de infusão. A faixa de tensão recomendada é de 15 a 25 kV. Espera-se uma diminuição no diâmetro do microportador com um aumento na tensão.
10. Quando a infusão estiver concluída, despeje cuidadosamente o excesso de nitrogênio líquido do Dewar, deixando os microtransportadores suspensos em ~ 25 mL de nitrogênio líquido para garantir que permaneçam congelados.
11. Transfira imediatamente os microtransportadores com o nitrogênio líquido para um tubo de centrífuga de 50 mL despejando em um movimento suave. Colete todos os microtransportadores congelados restantes no Dewar com uma escópula e adicione-os ao tubo da centrífuga.
    nota: Dependendo do tamanho do Dewar, os microtransportadores em nitrogênio líquido podem ser inicialmente despejados em um recipiente de tamanho médio e depois transferidos imediatamente para o tubo de centrífuga de 50 mL.
12. Cubra o tubo da centrífuga contendo os microtransportadores em nitrogênio líquido com papel alumínio perfurado com pequenos orifícios em preparação para liofilização.
13. Coloque os tubos de centrífuga cobertos em um frasco liofilizador. Ligar imediatamente o balão ao liofilizador e secar as amostras O/N.
    nota: É muito importante manter os microtransportadores suspensos em nitrogênio líquido para garantir que não descongelem antes desta etapa, pois o descongelamento pode resultar em colapso e/ou agregação. Os microtransportadores DAT, DDT e DLV fabricados a uma concentração de 35 mg/mL usando as condições de eletropulverização descritas acima normalmente terão um diâmetro hidratado variando entre 350–500 μm de tamanho. A distribuição de tamanho pode variar dependendo da fonte do ECM.
14. Armazene os microtransportadores liofilizados em um dessecador até que sejam necessários.

Resultados

Figura 1. Visão geral do aparelho de eletropulverização usado na fabricação de microtransportadores. A: Imagem mostrando a disposição dos principais equipamentos de eletropulverização, incluindo a bomba de seringa e a fonte de alimentação de alta tensão, bem como o posicionamento da agulha em relação ao Dewar de nitrogênio líquido. B: Esquema de eletropulverização, inclui...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cabos de garra jacaré	VWR	Rolamento 470149-728
papel-alumínio	Fisher Científico	01-213-101
Tubos de centrífuga (15 mL)	Sarstedt	Nº 62.554.205
Tubos de centrífuga (50 mL)	Sarstedt	Nº 62.547.205
Dessecador	Fisher Científico	8624426	Para armazenamento liofilizado de ECM e bioscaffold
Frasco Dewar	Fisher Científico	10-196-6	Forma baixa; faixa de volume de 250 a 500 mL
ECM (Matriz Extracelular)			Isolado de tecido adiposo humano, derme suína ou miocárdio suíno, conforme descrito em Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Nitrogênio líquido			Para eletropulverização
Liofilizador	Labconco	7750021	Zona Livre4.5
Agitador de incubadora orbital	SciLogex	8.3201E+11	Temperatura controlada (37 °C)
Suporte de retorta	VWR	Rolamento 470019-526
Grampo de suporte de retorta	VWR	Rolamento 21573-606
Seringa Safety-Lok	Bd	309606	Seringa Luer lock de 3 mL para fabricação de microtransportadores e suspensão de ECM de dispensação
Escópula	VWR	89259-968	Para coleta de microtransportadores
Bomba de seringa	VWR	10117-490	Controlado por microprocessador
Fonte de alimentação de alta tensão	Pesquisa de alta tensão gama	ES30P-5W/DDPM	Capaz da faixa de tensão recomendada de 15 a 25 kV
Conjunto de infusão alada	Terumo	22258092	Comprimento do tubo de 30 cm, 25 G 3/4" recomendado; Outros calibres de agulha podem ser usados e podem influenciar o diâmetro do microportador