Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de gotículas de matriz semissólida (< 1 min por placa)
- Coloque uma placa de fundo de poço de vidro pré-resfriado em um bloco de gelo embaixo do microscópio operacional. Certifique-se de que a alíquota da matriz permaneça no gelo o tempo todo.
- Coloque uma gota de matriz de 1,5 μL em cada um dos quatro cantos da placa de fundo de vidro com um micropipetador de 2 μL ou 10 μL, deixando uma distância pelo menos tão grande quanto a própria gota da borda do poço de vidro.
- Coloque a ponta da pipeta diretamente no vidro em um ângulo de 45 graus. Pipetar lentamente a matriz. Afaste-se lentamente do fundo de vidro depois que a matriz estiver engatada na placa.
nota: A tensão superficial entre a matriz e o vidro deve criar um hemisfério perfeito a cada vez.
- Pare de pipetar antes que a ponta esteja vazia, pois a injeção inadvertida de ar na gota da matriz torna o diâmetro da gota da matriz muito maior e é difícil de remover.
nota: Usar um ponteiro de segundos para estabilizar a mão de pipetagem facilita um posicionamento mais preciso.
2. Inserção de DRG em gotículas de matriz semissólida (< 2 min por placa)
- Deixe a placa com as gotículas da matriz brevemente à temperatura ambiente (~1 min). Isso endurece um pouco a matriz, facilitando o posicionamento preciso do DRG.
- Retire (não segure) o DRG suavemente com uma pinça microscópica fechada na mão esquerda. Novamente, um fundo escuro contra o pequeno DRG branco facilita a visualização. Transfira o DRG para a ponta de uma agulha 21G na mão direita. Esta transferência deixará meios residuais na pinça.
- Insira suavemente o DRG no meio da gota da matriz usando a agulha 21G (Figura 1). Na maioria das vezes, o DRG será facilmente liberado na matriz e, em seguida, poderá ser posicionado centralmente com a agulha.
- Se o DRG grudar na agulha, use a pinça microscópica para empurrar o DRG para fora da agulha e para dentro da gota da matriz. Remova o excesso de mídia da pinça microscópica com um lenço umedecido.
nota: A introdução de meios na matriz alterará o diâmetro, o volume e a consistência do ensaio. Um bloco de gelo com cor ou escrita colorida fornece contraste de fundo, o que facilita a visualização desse delicado processo.
- Depois que a placa tiver todos os quatro DRGs, execute uma inspeção final para garantir que o DRG esteja no centro da gota da matriz. Faça os ajustes necessários com a agulha 21G.
- Transferir a placa completa para uma incubadora a 37 °C. Isso solidificará a matriz semissólida e fixará o DRG na posição.
- Repita esse processo para todos os DRGs. Coloque gotículas de matriz em branco sem um DRG como controle negativo.
- Adicione 4 mL de DMEM com 10% de meio FBS a cada placa com fundo de vidro depois de completar todas as placas e expô-las à incubadora a 37 °C por pelo menos 3 min. Coloque a placa em um pequeno ângulo e adicione lentamente o meio, de modo que ele gradualmente entre em contato com as unidades de matriz DRG.
nota: Se o meio for adicionado muito rapidamente ou vigorosamente, a matriz e/ou DRG pode ser desalojada.
- Armazene os ensaios na incubadora a 37 °C pelos próximos 48–72 h.
nota: O exame periódico dos ensaios mostrará o crescimento circunferencial de neuritos em direção à borda da matriz (Figura 2). Quando os neuritos são maiores que três quartos do caminho para a matriz, é apropriado colocar as células em placas.
3. Preparação das células cancerosas de cabeça e pescoço
NOTA: Linhagens celulares diferentes de células escamosas de cabeça e pescoço
- Mantenha linhagens celulares de carcinoma de células escamosas em DMEM com 10% de FBS em frascos preferenciais ou placas de cultura em uma incubadora a 37 °C. Para preparar as células para experimentação, aspire todo o meio do frasco ou prato de cultura e lave-o duas vezes com PBS. Suspenda as células adicionando uma quantidade apropriada de tripsina a 0,025% por 5 min, seguida de DMEM com 10% de FBS. Pipetar 4 mL da mistura de células e meios em placas de cultura de 6 mL.
nota: Uma placa de cultura de 6 mL fornece células mais do que suficientes, mesmo quando menos de 50% confluentes.
- Exponha as linhagens celulares de CECP a diferentes condições 24 horas antes da coloração e plaqueamento no ensaio DRG. Dose novamente a condição assim que as células forem plaqueadas para manter um ambiente consistente.
nota: Adicione anticorpos, fatores de crescimento, citocinas ou outras moléculas às placas de cultura de células 1–2 dias após a dissecção do camundongo e a implantação do DRG na matriz.
- Adicione colorações de células fluorescentes 1 h antes de plaquear as células (2 a 3 dias após a colheita do DRG e implantação na matriz).
nota: As manchas específicas usadas aqui passam livremente pela membrana celular; no entanto, após reagir com grupos tióis intracelulares, a coloração permanece dentro da célula e é transmitida para as células-filhas. A coloração facilita muito a visualização dentro dos ensaios. Essas colorações temporárias são ideais para esses ensaios porque a fluorescência está presente por 2 a 3 dias, que é o período de tempo desses experimentos. Também permite o uso de muitas cores diferentes e evita a necessidade de criar linhas celulares transfectadas por proteínas fluorescentes.
- Prepare 10 μM de solução de corante misturando 2 μL de corantes de células estoque de 10 mM em 2 mL de DMEM sem soro para cada condição celular. Aqueça-o a 37 °C antes de adicioná-lo às células.
- Remova o meio de cultura dentro da placa de 6 mL, deixando as células aderentes ao CECP na placa. Adicione 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e remova 2 mL do DMEM sem coragem/soro celular de 10 μM adicionado a cada placa.
- Retorne a placa de cultura de 6 mL com a coloração celular para a incubadora a 37 °C por 40 min.
- Após 40 min, aspirar o meio. Adicione 2 mL de PBS e aspire. Adicione 1 mL de tripsina a 0,025% a cada placa e substitua-as na incubadora a 37 °C.
- Adicione 2 mL de DMEM com 10% de FBS após 3–5 min e transfira as células suspensas para um tubo cônico de 15 mL. Gire as células e ressuspenda-as em 1 mL de DMEM com 10% de FBS.
- Conte as células com um hemocitômetro ou contador de células automatizado e, em seguida, adicione DMEM com 10% de FBS para criar uma concentração celular final de 300.000 células por mL.
4. Revestimento de células cancerígenas de cabeça e pescoço
- Remova as placas com fundo de vidro com os ensaios de matriz DRG da incubadora.
nota: Novamente, eles são apropriados quando os neuritos estão a pelo menos 75% do caminho até a borda da matriz, o que geralmente ocorre após 2 a 3 dias. Isso é melhor visto usando pelo menos uma objetiva de 10X.
- Aspire o meio dentro da placa com fundo de vidro. Aspire completamente o meio dentro do poço de vidro sem remover as unidades de matriz DRG.
- Extraia 200 μL do meio de 300.000 células/mL usando uma pipeta de 200 μL. Coloque duas gotas das células sobre cada ensaio de matriz DRG. Execute esta etapa para cada gota de matriz, criando quatro repetições de cada condição de célula em uma placa.
nota: A forma hemisférica da matriz permite que as células se estabeleçam em um anel ao longo da periferia do ensaio (Figura 3a, Figura 3b). Encontrar uma pipeta com um gatilho suave torna a colocação de gotas uniformes muito mais fácil.
- Confirme números de células semelhantes e distribuição das várias condições celulares sob microscopia 4X.
- Coloque as placas com fundo de vidro na incubadora a 37 °C por aproximadamente 60 min.
nota: Embora haja apenas um pequeno volume de células e meios (~ 150 μL), os ensaios não secam até que várias horas de tempo de incubação tenham decorrido.
- Após 60 min, adicione suavemente 4 mL de DMEM com 10% de FBS ao longo da parede lateral da placa com fundo de vidro.
nota: Durante um período de tempo, as células aderem parcialmente ao fundo da placa e o método de adição do meio não perturba as células. Diferentes tipos de células podem levar mais ou menos tempo para começar a aderir à placa com fundo de vidro.
- Substitua quaisquer medicamentos exógenos ou fatores de crescimento neste momento para manter os níveis de concentração anteriores.
- Retorne os ensaios à incubadora a 37 °C, excepto quando forem examinados microscopicamente. Quantifique os resultados deste ensaio por imagem microscópica. Resumidamente, conte os filamentos de invasão perineural em quatro quadrantes usando uma imagem microscópica 4X.
nota: Um microscópio com objetiva 4X e recursos de fluorescência é adequado para foto-documentar os ensaios. O tamanho dos ensaios se encaixa perfeitamente no campo de uma objetiva 4X, que é detalhada o suficiente para capturar as áreas individuais de invasão perineural. A invasão perineural torna-se aparente em 24 horas, mas além de 48 horas, a integridade dos ensaios começa a enfraquecer, à medida que as células tumorais se dividem ao longo da periferia da matriz e invadem. Além de 48 h, há também um efluxo substancial de fibroblastos do DRG, que obscurece a visualização usando microscopia de campo claro. Portanto, é aconselhável fotodocumentar os resultados com microscopia 4X pelo menos duas vezes durante esta janela (por exemplo, 24 e 48 h após o plaqueamento das células tumorais). Lembre-se de que esses são ensaios tridimensionais e é difícil obter uma imagem completa de todo o ensaio. A maior parte da invasão perineural ocorre em um plano a partir do fundo da placa, onde as células estão embutidas na matriz ligeiramente acima do fundo da placa. Como esse plano está próximo da horizontal, a grande maioria dos neuritos com células tumorais é capturada em uma imagem de nível único em 4X.
