1. Seleção de uma População Lateral (SP) pelo Ensaio de Efluxo de Corante Hoechst
- Coloração de 50 milhões de células com corante Hoechst 33342
- Prepare dois tubos estéreis de 15 mL com fundo cônico: um tubo rotulado como "Hoechst" e o outro rotulado como "Hoechst e Verapamil". Prepare 10 mL de solução de cloridrato de Verapamil 5 mM em água estéril. Prepare o meio de cultura (CM) para células-tronco.
- Para preparar o CM para CSC (CM-CSC), combine o seguinte: meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% do soro fetal de bezerro (FCS), 0,04 mg / L de hidrocortisona, 100 U / mL de penicilina, 0,1 g / L de estreptomicina e 20 μg / L de fator de crescimento epidérmico (EGFR).
- Sob uma capela de fluxo laminar, tripsinize as células. Remova o meio, lave com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e adicione 1 mL de tripsina-EDTA (0,5 g/L) para um frasco de 75 cm². Incubar 3 min a 37 °C. Parar a reação adicionando um meio de cultura utilizado para a linhagem parental celular. Conte o número de células usando um contador de células.
- Para preparar o CM para a linhagem de células parentais (CM-P), suplemente o DMEM com 10% de FCS, 0,4 mg/L de hidrocortisona, 100 U/mL de penicilina e 0,1 g/L de estreptomicina).
- Diluir a suspensão celular obtida na etapa 1.1.2 para obter 107 células/mL em CM-P. Divida a suspensão celular nos dois tubos preparados: coloque 100 μL (106 células) no tubo "Hoechst e Verapamil" e 4 mL (4 x 107 células) no tubo "Hoechst".
- Na amostra "Hoechst e Verapamil", adicionar 10 μL de solução de cloridrato de Verapamil 5 mM (concentração final: 0,5 mM) e misturar suavemente. Adicionar 5 μL de solução Hoechst 1 g/L (concentração final: 0,1 g/L). Na amostra "Hoechst", adicionar 5 μl de solução Hoechst 1 g/L por 106 células (200 μl no total). Doravante, mantenha as amostras protegidas da exposição direta à luz usando papel alumínio.
- Incubar todos os tubos em banho-maria a 37 °C durante 1 h 30 min. Misturar suavemente de 15 em 15 minutos para evitar que as células se assentem.
- Tubos de centrífuga a 250 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet com 2 mL de 1x PBS.
- Tubos de centrífuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Remover o sobrenadante. Ressuspenda o pellet "Hoechst e Verapamil" em 500 μL de iodeto de propídio (PI) 5 mg/L diluído em tampão PBS e pellet "Hoechst" em 4 mL de PI 5 mg/L diluído em tampão PBS.
- Transferir as soluções das amostras através de um filtro de células de 70 μm para remover os agregados e recolher as células individuais em tubos para a recolha das amostras no citómetro de fluxo. Mantenha as amostras no gelo e proteja-as da exposição direta à luz usando papel alumínio.
2. Isolamento da população lateral, excluindo o corante Hoechst por classificação de células
- Realize a separação de células negativas Hoechst em um classificador de citometria de fluxo com os seguintes parâmetros: laser UV (355 nm), dois detectores no caminho do laser UV com filtros Hoechst azul (450/50 BP) e Hoechst vermelho (610/20 BP) e dois coletores.
- Primeiro, analise a amostra "Hoechst" que serve como controle positivo para coloração e configuração do citômetro de fluxo.
- Usando o software do citômetro, na janela "Planilha Global", clique em "Dot Plot" (quinta imagem superior direita) e crie um gráfico na planilha global. Na ordenada, com um clique com o botão direito, selecione FSC-A (dispersão direta) e na abscissa, SSC-A (dispersão lateral) (Figura 1A). Da mesma forma, crie um gráfico de pontos SSC-W versus SCC-H. Neste segundo gráfico de pontos, para criar uma região P1, clique em "Portão de polígono" (décima quarta imagem superior direita) (Figura 1B).
nota: A região P1 abrangerá células únicas e discriminará dupletos.
- Opcional: Exclua células PI positivas criando um FSC-A versus PI bloqueado em P1. Neste gráfico de pontos, selecione a população PI negativa (P2) para excluir células mortas PI positivas.
- Usando o software do citômetro, na janela "Planilha Global", clique em "Dot Plot" e crie um gráfico na planilha global. Em ordenada, com um clique com o botão direito, selecione azul Hoechst-A e em abscissa, vermelho Hoechst-A. Com um clique com o botão direito do mouse na população, selecione "Mostrar população" e P1. Neste gráfico de pontos, crie uma região (P2) para selecionar as células negativas da população lateral do corante Hoechst (SP) que aparecem como um braço lateral à esquerda da população principal de células (Figura 1C).
- Analise a amostra "Hoechst" e colete 10.000 eventos. Para garantir que a porta P2, que representa a população de SP, esteja bem posicionada, analise a amostra "Hoechst e Verapamil" (10.000 eventos) para observar o desaparecimento da população de SP (Figura 1D).
- Colete as células negativas do corante SP Hoechst em um tubo de 15 mL contendo 1 mL de CM-CSC preparado na etapa 1.1.1.
- No final da classificação das células, centrifugue a suspensão celular a 250 x g durante 5 min, retire o sobrenadante e ressuspenda o sedimento com 1 ml de CM-CSC. Contar o número de células ordenadas utilizando um contador de células e transferir um número adequado de células para um balão de cultura (ver quadro 1). Adicione CM-CSC e incube a 37 ° C e 5% de atmosfera de CO2.
- Manter as células em cultura nas mesmas condições durante um máximo de duas passagens até que haja um mínimo de 5 x 107 células.
Quadro 1: Tipo de balão de cultura a utilizar de acordo com o número de células classificadas. São fornecidos pormenores sobre a dimensão do frasco de cultura para um número aproximado de células classificadas. O volume de tripsina e o volume de meio necessários para o tipo de frasco de cultura também são fornecidos.
| Número de células classificadas | Tipo de balão de cultura | Volume de tripsina (mL) | Volume do meio de cultura (mL) |
| 10.000-200.000 | 1 poço de uma placa de 6 poços ou uma placa de Petri de 3,5 cm | 0,5 | algarismo |
| 200.000-1.000.000 | 1 frasco de cultura T25 | 1 | 4 |
| > 1.000.000 | 1 frasco de cultura T75 | algarismo | 10 |
