Extração da medula espinhal: um protocolo para isolar a medula espinhal murina para estudos in vitro

Resumo

Fonte: Na'ara, S. et al. Modelagem in vitro da invasão neural cancerosa: o modelo do gânglio da raiz dorsal. J. Vis. Exp. (2016)

Neste vídeo, descrevemos um protocolo passo a passo para isolar a medula espinhal de um modelo de camundongo para estudos in vitro.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Colhendo a medula espinhal

1. Eutanasiar o camundongo usando uma câmara de CO₂. Evite a luxação cervical, pois pode causar danos às raízes ganglionares devido às forças de cisalhamento. A partir daqui, execute todas as etapas em condições estéreis.
2. Mergulhe o animal com etanol 70%. Esta etapa é importante para a esterilização e para evitar que o cabelo se arraste pelos órgãos internos.
3. Deixe o rato secar do etanol. Evite qualquer contato do etanol com os órgãos internos devido à neurotoxicidade.
4. Depois de secar o mouse, posicione-o usando pinos na posição de bruços (face para baixo). Coloque os pinos em cada membro posterior e anterior.
5. Usando uma pinça, faça uma incisão na linha média estendendo-se craniocaudalmente da parte posterior do pescoço até a coluna lombar. Em seguida, levante os retalhos dérmicos bilateralmente com fórceps e exponha o tecido subcutâneo.
6. Palpe o crânio do camundongo até atingir a junção craniocervical. Usando uma tesoura perpendicular ao animal, corte os músculos cervicais e a coluna na junção craniocervical (a^7ª vértebra cervical), usando uma pinça pesada. Dissecar a coluna caudalmente e excisar a coluna com pinças pesadas até atingir o nível lombar (nível dos membros posteriores).
7. Realize uma transecção caudal completa no nível da coluna lombar (a^5ª vértebra lombar) usando uma pinça pesada.
8. Role o mouse (com a face para cima). Não há necessidade de cobrir a incisão, pois o DRG é extraído dos níveis vertebrais inferiores e não do cervical.
9. Corte na linha média do pescoço ao abdômen, retraia a pele lateralmente e depois corte para abrir o peritônio.
10. Remova os órgãos internos dentro do peritônio (fígado, baço, pâncreas, estômago e intestino) em bloco. Em seguida, remova os órgãos retroperitoneais (ou seja, rins e pâncreas). Cranialmente, abra a parede torácica.
11. Usando uma pinça e uma lâmina cirúrgica, corte as costelas, deixando 5 mm de costelas bilateralmente afastadas da coluna vertebral. Neste ponto, a coluna vertebral é separada do resto do corpo.
12. Lave a coluna vertebral do sangue com solução salina fresca tamponada com fosfato (PBS) fria (4 ° C) duas vezes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
fórceps	Sigma-Aldrich	F4142
Lâmina cirúrgica	Sigma-Aldrich	Z309036
tesoura	Sigma-Aldrich	S3271
Placas de Petri de 35 mm, fundo de vidro	de groot	Nº 60-627860
70% de etanol	sigma
PBS frio	Indústrias biológicas	02-023-1A