1. Ensaio MTT para células leucêmicas
- Prepare com antecedência a solução de MTT: Dissolva 500 mg de formazan MTT em 10 mL de PBS e agite (protegido da luz) com um agitador magnético por aproximadamente 1 h. Esterilize a solução com um filtro de 0,22 μm.
nota: A solução pode ser armazenada em alíquotas de 10 mL a -20 °C. Proteger da luz direta após o descongelamento.
- Prepare com antecedência o isopropanol acidificado: Adicione 50 mL de HCl 2 M a 2,5 L de isopropanol.
nota: Conservar a solução durante pelo menos um mês à temperatura ambiente antes de a utilizar. Se o isopropanol não for acidificado corretamente, pode formar precipitados com o meio e comprometer a leitura espectrofotométrica.
- Prepare uma placa separada de fundo plano de 96 poços "Dia 0" (controle) para garantir uma estimativa mais precisa da inibição do crescimento: Dedique 3 a 6 poços por linha celular, adicione 30 μL de meio de crescimento e 120 μL de suspensão celular (8.000 células) por cada poço e 150 μL de meio de crescimento aos poços correspondentes aos espaços em branco (sem células). Prossiga da etapa 1.9 para a etapa 1.13 desta seção para medir a densidade óptica (OD).
- Prepare uma placa experimental de fundo plano de 96 poços: Dedique 30 poços às concentrações de medicamentos (10 concentrações, cada uma em triplicata), 10 poços para células de controle e 10 poços para meio de controle sem células (brancos) e prepare uma faixa de diluição de medicamentos de dexametasona (Dex) usando dimetilsulfóxido como solvente.
nota: Para as células CEM-WT, a faixa de diluição Dex está entre 2 μM e 0,97 nM. Para as células CEM/R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, o intervalo de diluição Dex situa-se entre 640 μM e 0,33 nM.
- Adicione 30 μL de cada diluição Dex em um poço apropriado da placa de 96 poços. Certifique-se de incluir cada concentração em um triplicado.
- Adicione 30 μL de meio de crescimento aos alvéolos correspondentes às células de controle e 150 μL de meio de crescimento aos alvéolos correspondentes aos brancos.
- Colha células que crescem exponencialmente e ressuspenda em sua concentração ideal de semeadura.
nota: Para determinar as concentrações ideais de células iniciais, recomenda-se avaliar o perfil de crescimento de cada linhagem celular em uma placa de 96 poços, semeando células em várias concentrações e medindo-o diariamente por pelo menos 4 dias. Escolha uma concentração de semeadura que evite o crescimento excessivo de células após 72 h, pois isso influenciará o experimento saturando os valores de OD. Para CEM-WT, CEM-C5 e CEM-R5, a concentração ideal de semeadura é de 8.000 células/poço, enquanto para CEM/R30dm, é de 5.000 células/poço.
- Adicione 120 μL da suspensão celular a cada alvéolo contendo a solução do medicamento ou o meio de crescimento (alvéolos correspondentes às células de controle). Encha os poços externos vazios da placa com 150 μL de PBS para garantir uma boa umidade na placa e incube as placas por 72 h a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora de cultura de células.
- Adicione 15 μL da solução MTT a cada poço e agite a placa por 5 min com um agitador de placas até um máximo de 900 shakes/min.
- Coloque as placas de volta a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora de cultura de células e incube por mais 4–6 h.
- Adicione 150 μL de isopropanol acidificado a cada poço e misture bem com uma pipeta multicanal para ressuspender completamente todos os cristais de formazan. Comece com os poços em branco e certifique-se de enxaguar bem as pontas antes de prosseguir para outra fileira da placa.
- Incubar a placa à temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
- Usando um leitor de microplacas, determine o OD em 540 e 720 nm para garantir uma medição precisa, corrigindo o OD de fundo. Em seguida, salve os dados em um arquivo de planilha e analise-os.
2. Análise de dados para ensaio MTT
- Calcule os valores de OD das células no "Dia 0" usando a seguinte fórmula:
OD Dia 0 =Células de controle OD -Média de poços em branco OD
- Calcule a porcentagem de células sobreviventes para cada concentração de droga de acordo com a seguinte fórmula:
% de células tratadas = Média [Células tratadas com OD - Médiade poços em branco OD -OD Dia 0]/[Células de controle OD - Médiade poços em branco OD -OD Dia0]*100
- Traçar a curva dose-resposta (concentração do medicamento vs. inibição do crescimento em %).
- Calcule a concentração do medicamento que inibe o crescimento das células em 50% (IC50) usando a curva dose-resposta.
