1. Preparação de Materiais
- Lamínulas em autoclave
- Coloque as lamínulas em um copo de vidro.
- Cubra o copo de vidro com papel alumínio.
- Autoclave a 121 °C a 15 psi por 20 min.
- Secar a 50 °C. Conservar à temperatura ambiente numa capa de cultura.
- Prepare a solução de fixação: paraformaldeído a 3% + sacarose a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS)
- Em um frasco de vidro de 1.000 mL, adicione 700 mL de PBS e 30 g de paraformaldeído.
cuidado: O paraformaldeído é corrosivo, use luvas apropriadas.
- Dissolva completamente o paraformaldeído aquecendo a 80 °C usando um micro-ondas.
cuidado: Os vapores de paraformaldeído são tóxicos, use uma máscara.
- Deixe em temperatura ambiente durante a noite.
- Adicione 20 g de sacarose.
- Adicione PBS para fazer o volume total de 1 L.
- Alíquota em tubos de 50 mL. A solução de fixação pode ser armazenada por 3 anos a -20 °C ou por 3 meses a 4 °C.
2. Irradiação
CUIDADO: Manuseie o irradiador de raios X com cuidado de acordo com as instruções do fabricante.
- Examine as células sob um microscópio de fase invertida. Confirme se as células estão presas à lamínula e vivas.
- Irradie o prato com raios-X de 6 Gy (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Incubar por 72 h a 37 °C em atmosfera contendo 5% de CO2.
nota: O tempo de incubação pode ser modificado de acordo com o projeto experimental
3. Fixação
- Aspire os meios de cultura do prato.
- Com uma tesoura, corte a ponta de uma micropipeta de 1.000 μL a 5 mm da extremidade.
nota: A ponta cortada ajuda a aplicar suavemente a Solução de Fixação.
- Usando a ponta cortada, adicione 1 mL de solução de fixação (preparada na etapa 1.2) ao prato a partir da parede lateral do prato.
nota: Esta etapa é sensível ao tempo e, portanto, deve ser realizada sem alterar as ponteiras da micropipeta ao manusear várias amostras. A aplicação da solução de fixação diretamente no fundo do prato pode danificar as células.
- Coloque o prato em um prato quadrado de cultura. Agite suavemente a placa de cultura quadrada para distribuir a solução de fixação sobre a lamínula uniformemente.
- Incube por 10 min em temperatura ambiente.
- Solução de fixação aspirada do prato.
- Adicione 2 mL de PBS ao prato a partir da parede lateral do prato.
nota: A aplicação de PBS diretamente no fundo do prato pode danificar as células.
- Aspire PBS do prato.
- Repita as etapas 3.7 e 3.8 duas vezes.
nota: O prato pode ser armazenado por 1 semana a 4 ° C com as lamínulas banhadas em 2 mL de PBS.
4. Coloração DAPI
- Em uma lâmina de vidro, aplique 5 μL 1 μg/mL de reagente de coloração DAPI.
nota: O reagente de coloração DAPI é estável por 6 meses quando armazenado protegido da luz a -20 °C ou menos.
- Usando um bisturi, remova a lamínula do prato.
- Retire o excesso de PBS na lamínula tocando a borda da lamínula com uma toalha de papel.
- Monte a lamínula de cabeça para baixo na gota do reagente de coloração DAPI na lâmina de vidro para que as células sejam expostas ao reagente de coloração DAPI.
nota: Esta etapa é sensível ao tempo. A secagem do reagente de coloração DAPI pode levar a uma coloração abaixo do ideal.
- As amostras podem ser armazenadas por 1 ano a -20 °C.
