Triagem de morte celular usando coloração DAPI: um método para triagem rápida de morte celular clonogênica induzida por IR em linhagens de células cancerígenas

Abstract

Fonte: Kobayashi, D. et al. Protocolo de uma etapa para avaliação do modo de morte celular clonogênica induzida por radiação por microscopia de fluorescência. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a metodologia para rastrear os principais perfis de morte celular em linhagens de células cancerígenas induzidas por radiação ionizante (IR) usando o ensaio de coloração DAPI. Os núcleos corados com DAPI de células-alvo submetidas à morte celular exibem morfologias distintas e podem ser facilmente identificados por microscopia de fluorescência.

Protocol

1. Preparação de Materiais

1. Lamínulas em autoclave
   1. Coloque as lamínulas em um copo de vidro.
   2. Cubra o copo de vidro com papel alumínio.
   3. Autoclave a 121 °C a 15 psi por 20 min.
   4. Secar a 50 °C. Conservar à temperatura ambiente numa capa de cultura.
2. Prepare a solução de fixação: paraformaldeído a 3% + sacarose a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS)
   1. Em um frasco de vidro de 1.000 mL, adicione 700 mL de PBS e 30 g de paraformaldeído.
      cuidado: O paraformaldeído é corrosivo, use luvas apropriadas.
   2. Dissolva completamente o ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lamínula	Matsunami	C013001
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	Rolamento P6148-1KG
sacarose	Sigma-Aldrich	84097-250G
Solução salina tamponada com fosfato	Cosmo Bio	Rolamento 16232000
bisturi	Kai Médico	Nº 20, 520-A
Placa de cultura de células de 35 mm	falcão	353001
microscópio de fase invertida	Shimazu	Rolamento 114-909
Irradiador de raios X	Faxitron Bioptics	Faxitron RX-650
prato de cultura quadrado	Corning	Rolamento 431110
vidro deslizante	Matsunami	Pró-11
Reagente de coloração DAPI	Sinalização Celular	8961S
Microscópio de fluorescência	Nikon	ECLIPSE Ni
microscópio de fluorescência com filtro DAPI	Nikon	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
lente do microscópio da fluorescência (20×)	Nikon	Plano Apo λ 20X/0.75
lente de microscópio de fluorescência (60×, óleo)	Nikon	Óleo Plan Apo λ 60X/1.40
óleo	Olimpo	N5218600
Câmera CCD	Nikon	DS-Qi2
software de aquisição de imagens digitais	Nikon	Documento NIS-Elements
limpador de lentes	Olimpo	OT0552
clorofórmio	Wako	Telefone: 035-02616